ДНК-анализ

скопии»). Вероятность того, что у двух индивидуумов участки микросателлитной ДНК расположены одинаковым образом, очень мала (исключение – однояйцевые близнецы). Анализ снипсов (SNP) пациента является важной диагностической процедурой, направленной на установление индивидуальной переносимости и фармакологического действия лекарственных препаратов (методы фармакогеномики). В рамках проекта HapMap Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) к середине 2005 г. планировалось внести в базу данных информацию о примерно 4,5 млн снипсов (SNP) человека. Требуется около года для того, чтобы определить генотип человека по множеству снипсов (SNP) и точный фенотип (например, медикаментозную непереносимость). В селекции животных и растений анализ снипсов применяется для определения родства. С помощью генотипирования возможно с высокой точностью подтвердить состав сырья из трансгенных растений, а также определить наличие патогенных микроорганизмов в продуктах питания, крови или моче. Достаточно 1 мкл крови, чтобы определить наличие в ней возбудителя малярии Plasmodium falciparum. Протоколы процедуры генотипирования и правила амплификации целевых фрагментов ДНК требуют знания последовательности искомых фрагментов для использования подходящей ДНК-матрицы.

ПРЕНАТАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕНЕТИЧЕСКИХ БОЛЕЗНЕЙ. В настоящее время возможно выявление многих моногенных заболеваний плода уже на сроках беременности от 9 до 12 недель. В качестве источника ДНК используют образец эмбриональных клеток, которые отбирают через катетер из ворсинчатого хориона зародышевой оболочки плода. Техническая сторона этого метода анализа с целью оценки риска возникновения полигенных заболеваний в системе in vitro уже разработана (преимплантационная диагностика), однако вокруг этого вопроса сейчас развернута активная дискуссия, касающаяся этических аспектов.

Гибридизация ДНК нескольких генных локусов

a Проба ДНК, взятая на месте преступления б Пробы ДНК двух подозреваемых

ДНК. Для этого чип должен содержать полную последовательность одной цепи анализируемой ДНК в виде перекрывающихся фрагментов. К примеру, используя чип из 16 000 20-членных олигонуклеотидов в эксперименте по гибридизации, можно идентифицировать 179 из 180 известных полиморфных сайтов митохондриальной ДНК (мтДНК) человека.

ДЕТЕКТИРОВАНИЕ. Определение того, что произошла гибридизация, осуществляется, как правило, с использованием флуоресцентных красителей (красный «Cy3», зеленый «Cy5»), которые (как репортерные группы ковалентно связаны с dCTP) при ПЦР встраиваются в одноцепочечный ДНК-зонд. Детектирование происходит путем определения интенсивности флуоресценции лазерным сканером или ПЗС-матрицей (прибор с зарядовой связью). Другой метод детектирования основан на встраивании биотинилированных нуклеотидов; эта метка реагирует с авидином, «маркированным» золотом. Золотая метка может затем реагировать с коллоидным серебром, что приводит к 50-кратному усилению сигнала. В этом случае детектирование проводят наиболее простым методом, измеряя оптическое поглощение. Масс-спектрометри- ческие методы (MALDI-TOF) позволяют провести быстрый полуколичественный анализ гибридизации без использования маркерных молекул.

БЕЛКОВЫЕ МИКРОЧИПЫ. Вместо ДНК на микрочипы можно наносить изучаемые белки. В настоящее время ведутся попытки использовать рекомбинантные антитела или аптамеры при анализе протеомов.