- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Основы микробиологии
186
Бактериофаги
ВВЕДЕНИЕ. Бактериофагами (фагами) называются вирусы, которые инфицируют бактерии. Устойчивость к фаговой инфекции – один из важных критериев при получении штаммов-суперпродуцентов. В генетической инженерии бактериофаги используются для получения векторов и промоторов для клонирования, для секвенирования и для создания геномных или белковых библиотек. Чаще всего в качестве клеток-хозяев для клонирования используют клетки E. coli, поэтому бактериофаги (фаги λ, М13, Qβ, Т-фаг), заражающие эти бактерии, вызывают наибольший интерес.
ФАГ λ инфицирует клетки E. coli. Как и другие представители умеренных фагов, после заражения фаг λ может развиваться по одному из двух путей: литическому или лизогенному. При литическом росте геном фага, который представлен линейной двунитевой ДНК размером 48,5 т.п.н., многократно реплицируется вне хромосомы хозяина, а затем фаговые частицы высвобождаются из клетки, лизируя ее. Если реализуется лизогенный путь развития фага, его ДНК (размером ~1% хромосомной ДНК E. coli) встраивается в геном хозяина и реплицируется вместе с ним. Бактерии, содержащие интегрированный геном фага (профага), называются лизогенными. Повышение температуры, УФ-облучение или другой стресс приводит к высвобождению профага из генома E. coli и лизису клетки. В ДНК фага λ имеются так называемые cos-сайты – одноцепочечные 5'-конце- вые участки длиной 12 нуклеотидов, способные к комплементарному взаимодействию. После проникновения фага в клетку cos-сайты замыкаются, и образуется кольцевая молекула ДНК, репликация которой происходит по принципу «катящегося кольца». При этом образуются конкатемеры – последовательно соединенные копии фагового генома. Эндонуклеаза А – продукт гена А – расщепляет такую длинную молекулу по cos-сайтам, а затем отдельные молекулы фаговой ДНК пакуются в капсиды. На основе фага λ сконструировано множество векторов: например, космиды, используемые при создании геномных библиотек, или семейство λ-векторов, в которое входит вектор λEMBL4, индукция генов которого происходит при повышении температуры.
ФАГ М13 также инфицирует клетки E. coli, однако по строению этот вирус значительно отличается от фага λ. Геном фага М13 представляет собой одну молекулу одноцепочечной ДНК размером 6,4 т.п.н. После проникновения ДНК фага в клетку E. coli происходит синтез комплементарной цепи ДНК, и образовавшаяся двухцепочечная фаговая ДНК не встраивается в геном хозяина, а реплицируется в цитоплазме. Затем зрелые одноцепочечные молекулы ДНК фага М13 выходят из клетки, покрываясь
капсидом (~1000 фаговых частиц на клетку). Инфицированные клетки при этом не погибают и при делении передают фаговую ДНК дочерним клеткам (~ 100 молекул на клетку). Особенности жизненного цикла бактериофага М13 используются при получении исследуемых генов в виде одноцепочечной ДНК, например для секвенирования ДНК, а также при сайтнаправленном мутагенезе с применением ПЦР.
Т-ФАГИ разделены на семь типов. В генетической инженерии широко используются два фермента, кодированные в геноме Т-фагов: ДНК-лигаза фага Т4 – фермент, соединяющий «липкие» и «тупые» концы двух фрагментов ДНК, и ДНК-полимераза фага Т7, применяющаяся для секвенирования ДНК по методу Сэнгера–Коулсона. Промотор РНК-полимера- зы фага Т7 часто встраивают в векторы для экспрессии белков в клетках E. coli.
ФАГИ ДРУГИХ БАКТЕРИЙ. Среди более чем тысячи охарактеризованных фагов более 300 инфицируют энтеробактерии, 230 заражают бактериококки, а 150 – актиномицеты и бациллы. Для представителей рода Pseudomonas описаны более 100, а для бактерий рода Lactobacillus – 40 фагов. По строению и физиологии эти вирусы отличаются от фагов, специфических для E. coli. При производстве молочных продуктов особенно важна защита от фагов, инфицирующих бактерии рода Lactobacillus, так как они могут присутствовать в стартовых культурах. Как правило, стартовые культуры представлены генетически модифицированными штаммами, устойчивыми к фаговой инфекции. Такая устойчивость обусловлена экспрессией белковых продуктов, кодированных в плазмиде. В результате действия этих белков могут нарушаться процессы внедрения вируса в клетку или его репликации. Среди пяти изученных групп вирусов бактерий рода Bacillus фаги 105 и SPO2 широко используется для трансформации, а фаг PBS1 – при построении карты генома Bacillus subtilis. Фаг М3112 часто служит для трансформации бактерий рода Pseudomonas, а фаги SV1 и C31 – для введения ДНК в клетки Streptomyces.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Некоторые фаги Escherichia coli |
Инфекционный цикл фага М13 |
||
|
|
|
Фаг М13 |
Название и форма фага |
Генетический |
Пиль |
ДНК E. coli |
|
материал |
|
|
Фаг Т2 или Т4 |
нм |
ДНК фага М13 |
Инфекция |
Головка фага |
|
|
|
95,0 |
|
|
|
Воротничок |
|
|
|
ДНК (двух- |
|
|
|
|
|
|
|
Хвост (ядро, |
цепочечная) |
Из инфициро- |
|
оболочка) |
|
|
|
|
ванной клетки |
|
|
Базальная |
|
|
|
|
непрерывно |
|
|
пластинка |
|
выбрасываются |
Реплицированная |
Нить отростка |
|
новые фаговые |
|
|
частицы |
ДНК фага М13 |
|
Фаг λ |
|
||
ДНК (двух- |
|
|
|
|
|
|
|
|
цепочечная) |
|
|
Фаг М13 |
|
|
|
6 нм |
ДНК (одно- |
|
|
цепочечная) |
|
|
|
900 нм |
|
|
|
|
|
|
|
Фаг МS2 |
РНК |
Инфицированные клетки |
|
|
продолжают делиться и высвобождают |
||
|
|
новые фаговые частицы |
|
Инфекционный цикл фага λ |
|
Литический путь |
|
|
|
|
|
|
ДНК E. coli |
|
Лизогенный путь |
|
Инфекция |
|
Репликация |
Лизис клетки |
|
|
|
фага |
E. coli |
|
|
Нормальное |
|
|
|
|
|
деление |
|
|
|
|
|
клетки E. coli |
|
|
|
|
|
Интеграция в бак- |
|
|
|
|
|
териальный геном |
|
|
|
|
|
Исключение из бак- |
|
|
|
||
териального генома |
|
|
|
||
Линейная форма ДНК фага λ |
Кольцевая форма ДНК фага λ Генетическая карта фага λ |
|
|||
|
|
cos-сайт |
|
|
т.п.н. |
|
|
|
|
|
|
Левый «липкий» |
Правый «липкий» |
Лизис клетки-хозяина |
49 |
||
|
|||||
конец |
конец |
|
|
||
|
Регуляция поздних генов |
|
|||
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Синтез ДНК |
|
|
|
|
Регуляция ранних генов |
40 |
|
Фаг 3 |
Фаг 2 |
Фаг 1 |
|
|
|
cos |
|
|
|
|
|
cos |
cos |
cos |
Встраивание и вырезание |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
из генома хозяина |
30 |
Разворачивание конкатемера из молекул ДНК фага λ |
|
Гены |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
с неизвестными функциями |
|
|
|
|
|
|
|
20 |
Эндонуклеаза ( ), закодированная в геноме фага λ, |
Компоненты капсида |
10 |
|||
|
и его образование |
|
|||
расщепляет конкатемер по cos-сайтам |
|
|
|||
|
|
|
|||
Образование новых фаговых частиц |
|
|
0 |
187
Основы микробиологии
188
Микроорганизмы
ВВЕДЕНИЕ. Многие ключевые реакции круговорота |
гидроксимасляная кислота или полифосфаты. Благо- |
веществ в природе осуществляются только микроор- |
даря разнообразию обмена веществ представители |
ганизмами. В частности, микроорганизмам принад- |
группы эубактерий встречаются в любой природной |
лежит ведущая роль в осуществлении процессов рас- |
среде, этому также способствуют своеобразные пути |
пада. Эти процессы особенно важны для высших |
эволюционирования белков и кофакторов эубакте- |
организмов, поэтому в природе часто имеют место |
рий. Например, пурпурная мембрана галобактерий |
симбиотические отношения между высшими орга- |
обладает некоторыми функциональными свойствами |
низмами и микроорганизмами. В качестве примеров |
(в том числе способностью к фотосинтезу), позволя- |
можно привести лишайники (симбиоз между грибами |
ющими считать этих бактерий древнейшими предше- |
и водорослями), бактерии в рубце у крупного рогато- |
ственниками высших организмов. |
го скота или кишечную флору млекопитающих. |
АРХЕБАКТЕРИИ (АРХЕИ). Считается, что археи суще- |
В то же время некоторые микроорганизмы являются |
ствовали сотни миллионов лет до нашей эры и что |
возбудителями различных заболеваний. Непатоген- |
это одна из самых древних форм жизни на Земле. |
ные микроорганизмы широко используются в биотех- |
Для большинства архей характерен анаэробный об- |
нологии: при получения таких важных продуктов, как |
мен веществ (т. е. они могут существовать в отсутст- |
лимонная кислота, антибиотики, ксантановые смолы |
вие кислорода), и они часто встречаются в так назы- |
и применяемые в научных и производственных целях |
ваемых экстремальных средах. Например, только |
ферменты, а также при аэробной или анаэробной |
представители архей осуществляют превращение ук- |
очистке сточных вод, воздуха и почвы и в синтезе ре- |
сусной кислоты в метан – реакция, лежащая в осно- |
комбинантных белков. В силу своего относительно |
ве биотехнологической очистки сточных вод. От эу- |
простого строения микроорганизмы часто служат в |
бактерий археи отличаются по структурным и |
качестве модельных организмов при изучении биохи- |
генетическим признакам. Например, клеточная стен- |
мических, генетических и физиологических процес- |
ка архей построена не из фосфолипидов, а из эфи- |
сов. Разработано много методик проведения мута- |
ров глицерина. В связи с экстремальными условиями |
генеза, и преимущество микроорганизмов для таких |
обитания архей их ферменты часто обладают специ- |
экспериментов заключается в их сравнительно |
фическими свойствами, и эти особенности использу- |
коротком жизненном цикле. Раньше классификация |
ются в биотехнологии. Так, ДНК-полимераза Pyro- |
микроорганизмов была основана на клеточном |
coccus furiosus, обитающей в глубоководных озерах, |
строении: их делили на прокариотические и эука- |
применяется для ПЦР в тех случаях, когда необходи- |
риотические; однако согласно современным предста- |
ма повышенная точность интерполяции нуклеотидов. |
влениям, среди прокариот выделены также археи и |
ДРОЖЖИ И ГРИБЫ. Все дрожжи и грибы (около |
эубактерии (около 6000 полностью охарактеризован- |
70 000 штаммов) – эукариоты. В отличие от прока- |
ных штаммов). |
риот их клеточная стенка построена из хитина или, |
ЭУБАКТЕРИИ, или истинные бактерии, – это однокле- |
реже, из целлюлозы. Практически все грибы – гете- |
точные организмы размером около 1 мкм, размно- |
ротрофы и осуществляют аэробное дыхание. В осно- |
жающиеся делением. Как и все прокариоты, эубакте- |
ве классификации грибов лежит способ их размно- |
рии не имеют клеточного ядра. ДНК эубактерии |
жения. Вегетативное тело грибов (мицелий) состоит |
называется нуклеоидом. Эубактерии часто содержат |
из системы ветвящихся нитей (гиф). Наиболее рас- |
нехромосомные ДНК, например плазмиды, в которых |
пространено бесполое размножение, которое осуще- |
хранится часть генетического материала. Плазмиды |
ствляется спорами или в результате почкования. По- |
могут распространяться в результате горизонтально- |
ловой процесс у низших грибов (фикомицетов) |
го обмена генами – чрезвычайно важного процесса, |
происходит с участием гамет, а у высших грибов для |
обеспечивающего естественную эволюцию метабо- |
этой цели формируются разнообразные плодовые те- |
лизма бактерий, в том числе образование штаммов, |
ла, например сумки у аскомицетов или базидии у ба- |
устойчивых к антибиотикам. В зависимости от строе- |
зидиомицетов. Форма плодового тела также при- |
ния клеточной стенки бактерии делятся на грамполо- |
знак, используемый при классификации грибов. |
жительные и грамотрицательные, при этом грамот- |
|
рицательные бактерии имеют более сложно |
|
устроенную клеточную стенку, чем бактерии, окраши- |
|
вающиеся по методу Грама (грамположительные). |
|
Клетки многих бактерий покрыты слизистой оболоч- |
|
кой, а также имеют выросты, позволяющие им пере- |
|
двигаться. В цитоплазме бактериальных клеток могут |
|
накапливаться запасные вещества, например поли- |
|
Микроорганизмы
Escherichia coli –
представитель прокариот
Рибосомы |
Хромосома |
Цитоплазма |
Плазмидная ДНК |
Пиль (фимбрия) |
Клеточные |
включения |
Клеточная мембрана |
Клеточная стенка |
Капсула или |
слизистая оболочка |
Жгутик |
Saccharomyces cerevisiae – представитель эукариот
Шероховатый ЭР |
Ядрышко |
|
(с рибосомами |
Ядерная оболочка |
|
на внешней |
||
поверхности) |
(двойная |
|
|
мембрана) |
|
|
Ядро |
|
Лизосомы |
Вакуоли |
|
|
||
Гладкий ЭР |
|
|
Цистерны |
|
|
аппарата Гольджи |
Цитозоль |
|
Пузырьки |
||
|
||
аппарата Гольджи |
|
|
Плазматическая |
Митохондрии |
|
мембрана |
||
|
||
ЭР = эндоплазматический |
Цитоскелет |
|
ретикулум |
|
|
E. coli |
S. cerevisiae |
Сравнение |
|
|
|
животной и |
|
|
|
растительной клеток |
Клеточное ядро, органеллы |
Нет |
Есть |
Есть |
Длина клетки, мкм |
~ 1 |
~ 10 |
100 |
Объем клетки, мкм3 |
~ 1 |
~ 1000 |
> 10 000 |
Дыхание, мкл О2/(мг высушенных клеток ч) |
1000 |
100 |
10 |
Время удвоения, ч |
0,3 |
1,5 |
> 20 |
Число генов |
~ 4300 |
~ 6400 |
> 30 000 |
Положение микроорганизмов на эволюционном дереве
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Археи |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Бактерии |
|
|
Прокариоты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Неживая |
|
|
Бактерии |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Цианобактерии |
|
|
|
||||
материя |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Грибы |
|
|
Эукариоты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Растения |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Животные |
|
|
|
|
|
4 |
3 |
2 |
1 |
|
Настоящее |
|
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
109 лет |
|
|
|
|
|
|
|
время |
|
|
|
|
||
Археи, бактерии и эукариоты (на примере грибов) |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Археи |
|
|
|
Эубактерии |
|
|
|
Грибы, дрожжи |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
Тип клетки |
|
|
|
Прокариотический |
|
|
|
Прокариотический |
Эукариотический |
|||||||||||
Клеточная стенка |
Гликопротеин (псевдомуреин) Пептидогликан (муреин) |
Полисахариды (гликаны), |
||||||||||||||||||
|
|
|
|
и гетерополисахариды |
|
|
|
|
|
|
|
хитин |
||||||||
Липиды, входящие |
Эфиры глицерина |
|
|
|
Фосфолипиды |
|
|
|
Фосфолипиды |
|||||||||||
в состав клеточной |
и изопреноидного спирта |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||||||
мембраны |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Инициаторная тРНК Содержит метионин |
|
|
|
Содержит формил-метионин |
Содержит метионин |
|||||||||||||||
Генетический |
|
|
|
Небольшая кольцевая |
Небольшая кольцевая |
Сложное ядро,как минимум, |
||||||||||||||
материал |
|
|
|
хромосома, плазмиды |
хромосома, плазмиды |
с двумя большими хромосо- |
||||||||||||||
|
|
|
|
в комплексе с гистоно- |
|
|
|
|
|
|
|
мами в комплексе с гис- |
||||||||
|
|
|
|
подобными белками |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
тоновыми белками |
|||||
РНК-полимераза |
Сложное строение |
|
|
|
Простое строение |
Сложное строение |
||||||||||||||
Размер рибосом |
70S |
|
|
|
70S |
|
|
|
80S |
189