Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Шмид Р. Наглядная биотехнология и генетическая инженерия..pdf
Скачиваний:
520
Добавлен:
30.05.2021
Размер:
9.07 Mб
Скачать

Биотехнология в медицине

128

Факторы свертывания крови

ВВЕДЕНИЕ. Для предотвращения кровопотери при повреждении сосудов существует эффективный механизм, заключающийся в образовании тромба. Этот процесс, называемый гемостазом, представлен сложным набором реакций, проходящим в несколько этапов: активация зимогенов (предшественников протеиназ), протеолиз и ингибирование протеолиза. Cложная система регуляции свертывания крови предотвращает образование тромбов в неповрежденных сосудах. При свертывании крови растворимый белок фибриноген превращается в нерастворимый полимер фибрин путем протеолиза, катализируемого сериновой протеиназой тромбином. В таком «мягком» тромбе фактор XIIIа (фермент трансглутаминаза) обеспечивает формирование амидных связей, что приводит к формированию нерастворимого сгустка. В свою очередь тромбин образуется из протромбина под действием фактора Xа, а в регуляции этого процесса принимают участие белки фактора VIII. Мутации в генах белков фактора VIII являются причиной наиболее распространенных генетических заболеваний крови – гемофилии А и В.

ГЕМОФИЛИЯ. Первые упоминания об этой болезни встречаются на глиняных дощечках, дошедших до нас из Древнего Египта. Существует три клинических типа заболевания: гемофилия А, гемофилия В и болезнь фон Виллебранда. Гемофилия А встречается только у мужчин с частотой 1 на 5000. Причина патологии заключается в нарушении биосинтеза фактора VIII. У больных гемофилией А содержание фактора VIII в крови составляет менее 1% нормы, по этой причине спонтанное кровотечение, как правило, приводит к смерти. В генах фактора VIII, расположенных на Х-хромосоме, у больных гемофилией А обнаруживается инверсия интрона F8A, которая и приводит к нарушению биосинтеза белка в клетках печени. Фактор VIII – это гликопротеин (МR 300), представляющий собой одну полипептидную цепь из 2332 аминокислотных остатков. Она содержит 25 участков гликозилирования, и содержание сахара может достигать 35%. Его пространственная структура установлена с помощью электронной криомикроскопии. Ген фактора VIIIa имеет размер ~186 т.п.н. и содержит 26 экзонов. Посттрансляционное гликозилирование особенно важно в В-домене белка, который под действием тромбина отщепляется, что и приводит к активации фактора VIII. Болезнь фон Виллебранда, встречающаяся с частотой 1 на 1000 среди мужчин и женщин, вызвана нарушениями биосинтеза фактора фон Виллебранда (vWF) на внутренней стенке кровеносных сосудов. Ген vWF находится в хромосоме 12. Фактор фон Виллебранда, как и фактор VIII, – гликопротеин большого размера со сложной структурной органи-

зацией. Около 100 молекул vWF связываются с молекулой фактора VIII, и образующийся комплекс vWF–VIII активирует систему факторов X/IXа, которая обеспечивает агрегацию тромбоцитов при образовании тромба. При гемофилии В, встречающейся только у мужчин с частотой 1 на 25 000, нарушен синтез фактора IX – гликопротеина с молекулярной массой 55 кДа. Наряду с фактором VIII фактор IX участвует в активации фактора X. Ген, кодирующий фактор IX, расположен на X-хромосоме (Xq27) и имеет размер ~34 т.п.н.

КЛОНИРОВАНИЕ. При клонировании факторов крови, впервые осуществленного в 1982 г. компаниями Genentech и Genetic Institutes, оказалось, что главное затруднение связано с очень низким содержанием мРНК (лишь 10–5 от всей мРНК в печени). Полную кДНК удалось выделить из клеток лимфомы методом «прогулки по геному», а затем была создана векторная система, включающая в себя элементы вируса SV40 и аденовируса. Такая система позволила экспрессировать факторы крови в CHO- и BHKклетках.

ПРОИЗВОДСТВО. Производство лекарственных препаратов, содержащих факторы крови, началось в 1964 г. Факторы VIII, IX и vWF получали криопреципитацией из крови доноров, а затем очищали методами иммунохроматографии. Однако при этом значительно возрастала степень риска заражения реципиента через кровь донора, так как, например, для обеспечения одного больного гемофилией А фактором VIII в течение года требовалась кровь нескольких тысяч доноров. В результате более 60% пациентов, которые использовали донорские факторы крови, приобрели инфекционные заболевания. По этой причине генно-инженерный метод получения факторов VIII

иIX, разработанный в 1992 г., имеет огромное значение. Из-за высокого уровня гликозилирования фактора VIII синтез его биологически активной формы возможен исключительно в животных клетках (CHO-

иBHK-клетках), где уровень экспрессии чрезвычайно низок и составляет микрограммы продукта на литр клеточной культуры. Объем его рынка составляет около 500 млн долл. США в год (2004 г.).

Тяжелые болезни крови

 

 

 

 

 

 

 

 

Гемофилия А

Болезнь фон Виллебранда

Гемофилия В

Наследуемость

 

1:5000, только мужчины

1:1000, мужчины и женщины,

1:25000, преиму-

 

 

 

 

как правило аутосомно-

 

щественно мужчины

 

 

 

 

доминантный тип наследования

 

 

Клинические

 

Мышечные и суставные

Кровотечения из носа, значи-

В детстве спонтанные

проявления

 

кровотечения, крово-

тельные потери крови в менстру-

кровоизлияния

 

 

излияния в мозг

альном цикле, продолжительные

в суставы

 

 

 

 

кровотечения при порезах

 

 

Хромосомный локус

Xq28

 

12р12

 

Xq27

Нормальный синтез

Дефектный синтез

Дефектный синтез при болезни

комплекса фактора VIII

при гемофилии А

фон Виллебранда

 

Хромосома 12:

 

 

Хромосома 12:

 

 

Хромосома 12:

X-хромосома:

 

ген фактора

X-хромосома:

ген фактора

X-хромосома:

ген фактора

ген

фон Виллебранда

ген

 

фон Виллебранда

ген

 

фон Виллебранда

фактора VIII

Внутренняя

фактора VIII

 

Внутренняя

фактора VIII

Внутренняя

Клетки

 

стенка

Клетки

 

стенка

Клетки

стенка

кровеносного

 

кровеносного

кровеносного

печени

 

сосуда

печени

сосуда

печени

сосуда

 

 

 

Блокирован

 

 

 

 

Блокирован

 

 

 

 

 

 

 

 

Быстрая

 

 

 

 

 

 

 

 

деградация

 

 

 

 

 

 

 

 

в отсутствие vWF

Полноценный фактор VIII

Только vWF

 

 

 

Комплекс фактора VIII состоит из фактора VIII и фактора фон Виллебранда (vWF)

 

 

Фактор VIII: структура гена и экспрессирующий вектор

 

 

 

0

 

50

100

 

150

 

200 т.п.н.

 

 

 

 

 

 

 

 

Ген

 

 

 

 

 

 

 

 

содер-

 

 

 

 

 

 

 

 

жит 26

 

 

 

 

 

 

 

 

экзонов

Одноцепо-

 

 

 

 

 

 

 

 

чечный

 

 

 

 

 

 

 

 

фактор VIII

 

Связывание с фактором

Связывание

 

 

 

 

 

с фосфоли-

 

 

 

 

 

 

фон Виллебранда

 

 

 

 

 

 

пидами

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Белок плазмы

 

110–200 кДа

 

80 кДа

 

 

 

 

 

 

Тромбин

 

 

 

 

 

Активация

 

50 кДа 43 кДа

 

 

73 кДа

 

 

 

 

 

 

Активация белка С

 

Точка начала репликации

 

 

 

 

Селективный маркер

 

 

 

 

 

 

Инактивация

45 кДа

 

 

73 кДа

Промотор (из генома аденовируса)

 

 

 

 

 

 

Терминатор

 

 

Получение фактора VIII

 

 

 

 

 

 

Из крови доноров

 

 

Фактор фон Виллебранда

 

 

 

 

500 доноров

 

 

 

Очистка

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

100 л плазмы,

 

 

 

Осажение, многоступенчатая

 

 

1 мг фактора VIII

1 кг криопреципитата

 

 

 

иммунохроматография

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рекомбинантный фактор VIII

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Биореактор с культурой клеток

 

Очистка

 

 

Около 2 мг

Рекомбинантные

 

 

 

 

 

 

 

фактора VIII

200 ч, 35 °С,

 

Осажение, многоступенчатая

клетки CHO

 

 

 

из 1 л клеточ-

 

 

 

 

сложная питательная среда

 

иммунохроматография

 

 

ной культуры

129

медицине

Антикоагулянты и тромболитики

ВВЕДЕНИЕ. Образование тромбов (инфаркт миокар-

да, инсульт, закупорка сосудов) является самой

в

распространенной причиной смерти в большинстве

Биотехнология

развитых стран. В Германии от тромбозов ежегодно

 

 

умирают 60 000 человек. Антикоагулянты препятст-

 

вуют образованию первичных тромбов (в том числе

 

при операциях), а тромболитики осуществляют про-

 

теолитическое разрушение тромбов. В медицине

 

находят применение такие антикоагулянты, как

 

гепарин и производное кумарина, а также рекомби-

 

нантные ингибиторы тромбина – гирудин (природ-

 

ный источник – медицинские пиявки) и антитром-

 

бин III человека (АТ-III). В качестве тромболитиков

 

используют бактериальную стрептокиназу, а также

 

препараты урокиназы и тканевого активатора плаз-

 

миногена (tPA и rPA), полученные методами гене-

 

тической инженерии.

 

ГЕПАРИН – серосодержащий глюкозоаминогликан

 

(мукополисахарид) с MR от 3 до 60 кДа. Его экстра-

 

гируют из кишечника свиней или легких крупного ро-

 

гатого скота. Гепарин синтезируется тучными клетка-

 

ми и, оказавшись в плазме крови, активирует АТ-III,

 

который в свою очередь связывается с тромбином и

 

препятствует образованию фибрина.

 

ГИРУДИН – ингибитор тромбина, обнаруженный в

 

секрете слюнных желез медицинской пиявки. В на-

 

стоящее время рекомбинантный гирудин получают

 

ферментацией в клетках Escherichia coli и в других

 

организмах-хозяевах. Действие гирудина аналогично

 

действию АТ-III: он связывается с тромбином, тем са-

 

мым препятствуя образованию фибрина из фибрино-

 

гена.

 

ТКАНЕВОЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА (tissue plas-

 

minogen activator, tPA). Расщепление фибрина при

 

заживлении раны осуществляется сериновой протеи-

 

назой плазмином. Активная форма плазмина образу-

 

ется из плазминогена под действием тканевого акти-

 

ватора плазминогена (tPA, MR 72). Это еще одна

 

сериновая протеиназа, которая специфически расще-

 

пляет пептидную связь между остатками аргинина и

 

валина (в положениях 561 и 562) в молекуле плаз-

 

миногена. Белок построен из пяти доменов, функции

 

которых установлены на основании гомологии с дру-

 

гими изученными белками. Функция двух доменов,

 

имеющих форму торов, заключается в связывании с

 

молекулой фибрина, а так называемый протеазный

 

домен содержит активный центр фермента. Ген tPA

 

человека был клонирован в 1982 г., а с 1988 г. пре-

 

параты этого белка поступили на рынок. Наличие

 

в зрелом tPA восьми дисульфидных связей и трех

 

крупных углеводных компонентов, составляющих

 

~25% массы и необходимых для связывания с суб-

130

стратом, не позволяет использовать бактериальные

клетки в качестве клеток-хозяев. Для получения

рекомбинантного tPA выбирают клетки мышей или клеточные линии СНО, а образующийся белок очищают различными способами, включающими осаждение в кислой среде, а также ионообменную, гидрофобную и аффинную хроматографию. Мутанты производят фермент с искусственно измененным сайтом гликозирирования и четырьмя аминокислотными заменами (TNK-tPATM), который прочно связывается с фибрином и имеет более продолжительное время полураспада в сыворотке. В этой связи вместо использования инфузии можно провести однократное введение. Мутанты E. coli с нарушенной функцией гликозилирования синтезируют фермент, лишенный петлевого-1 и eGF-доменов (RepilysinTM), однако его выделение из телец включения оказывается затруднительным. По сравнению с tPA время пребывания этого белка в сыворотке в 3–4 раза больше, а аллергенные свойства выражены слабее. tPA также секретируется с молоком трансгенных коз и овец, которые трансформированы вектором, содержащим фрагмент tPA-кДНК под промотором лактальбумина. Белок tPA, кроме того, получают из молока трансгенных коз и овец, в которых ген tPA клонирован за промотором лактальбумина. Для контроля однородности полученного таким способом tPA требуется применение специальных аналитических методов.

ДРУГИЕ ТРОМБОЛИТИКИ. Урокиназа – сериновая протеиназа; в виде проурокиназы присутствует в сыворотке крови и в моче. Подобно tPA, урокиназа гидролизует плазминоген с образованием плазмина. Обнаружены две формы белка с MR 54 и 30: белок меньшего размера образуется из большего при автолизе, и обе формы обладают биологической активностью. Урокиназу выделяют из мочи, культуры клеток почек человека или в виде рекомбинантного продукта из клеток E. coli. Стрептокиназа образуется в различных гемолитических стрептококках. Этот белок не обладает каталитической активностью, однако вызывает конформационные изменения в молекуле плазминогена, что приводит к автолизу с образованием плазмина. Стрептокиназу получают из культур стрептококков методами хроматографии. Применение других, более дешевых способов очистки белка, связано с риском возникновения сильных иммунных реакций.

Упрощенная схема тромболиза

 

 

 

Тромболиз

Свертывание крови

 

Ингибирование

 

 

Фибриноген

Гирудин

Тканевой

 

Активация

 

 

 

активатор

 

 

Тромбин

Протеолитическое

плазминогена,

Плазминоген

 

урокиназа,

 

 

 

расщепление

стрептокиназа

Плазмин

Фибрин

Антитромбин-III

Гепарин

 

Антикоагулянты (А) и тромболитики (Т)

 

 

 

Тип

Действие

Производитель

Гепарин

А

Серосодержащий полисахарид, связывается

Celsus

 

 

с антитромбином III и инактивирует тромбин

 

Гирудин

А

Ингибирует тромбин

Novartis, Behringwerke*

Антитромбин-III

А

Ингибирует тромбин

Genzyme Transgenic Corp.

Стрептокиназа

Т

Активирует плазминоген

Kabi Upjoin*

Урокиназа

Т

Активирует плазминоген

Grüenenthal*

Тканевой активатор

T

Активирует плазминоген

Genentech*, Boehring,

плазминогена

 

 

Ingelheim*, Roche*

 

 

 

 

* Препарат разрешен к применению

Природное соединение

Рекомбинантный белок

Тканевой активатор плазминогена

 

 

 

 

Ретеплаза –

 

 

Участки

 

 

 

гликозилирования

Протеазный

мутантный белок,

 

 

 

 

домен

не содержащий

 

Домен с протео-

 

домена

 

 

 

 

 

литической

 

фактора роста

 

 

 

активностью

 

и «тора 1»,

 

 

 

 

 

 

 

 

может

 

 

Участок связыва-

 

существовать

 

«Тор 2»

 

ния субстрата

в крови в 3 раза

 

 

дольше, чем

 

 

Участок связыва-

 

нативный белок

 

 

 

ния с фибрином

 

 

 

 

«Тор 1»

 

 

 

Участок связыва-

 

 

 

 

 

 

 

 

ния с рецептором

Фактор роста

 

 

 

 

 

(домен Е)

 

 

 

 

 

«Палец»

 

 

N-Конец

 

 

(домен F)

 

 

 

 

Получение тканевого активатора плазминогена (пример)

 

 

 

Рекомбинантные

Клеточный реактор

Выделение и очистка

Выход

Клеточный

клетки СНО

 

 

 

Реактор объемом до 20 м3,

Многостадийная

 

продукта

реактор

 

 

Вектор

сложная питательная

иммунохроматография

несколько

 

 

СНО-NEOSPLA

среда, 37°С, 20 сут.

 

 

мг/л в сут.

 

Трансгенное

Характеристика

Выделение и очистка

Выход

Трансгенные

животное

животного

 

 

Осаждение в кислых

продукта

козы

 

 

Вектор LSAP + PA

 

до 30 г/л

 

Период лактации 240 дней,

условиях, бутилсефароза,

 

 

3–4 л молока в день

иммунохроматография

молока

 

 

 

 

 

Контроль качества

 

 

 

Обращенно-фазовая ВЭЖХ, электрофорез в денатурирующих условиях, ELISA,

 

 

пептидное картирование, определение степени гликозилирования и другие методы

 

 

 

 

 

 

131