- •Содержание
- •Предисловие
- •Предисловие ко 2-му изданию
- •Введение
- •Этапы развития биотехнологии
- •Биотехнология сегодня
- •Биотехнологическое производство пищевых продуктов
- •Алкогольные напитки
- •Пивоварение
- •Ферментация в пищевой промышленности
- •Пищевые продукты и молочнокислое брожение
- •Этиловый спирт
- •1-Бутанол, ацетон
- •Уксусная кислота
- •Лимонная кислота
- •Молочная и глюконовая кислоты
- •Аминокислоты
- •L-Глутаминовая кислота
- •D,L-Метионин, L-лизин и L-треонин
- •Антибиотики
- •Антибиотики: источники, применение и механизмы действия
- •Антибиотики: получение. Устойчивость к антибиотикам
- •β-Лактамные антибиотики: промышленное получение
- •Гликопептидные, полиэфирные и нуклеозидные антибиотики
- •Аминогликозидные антибиотики
- •Тетрациклины, хиноны, хинолоны и другие ароматические антибиотики
- •Поликетидные антибиотики
- •Получение новых антибиотиков
- •Специальные продукты
- •Витамины
- •Нуклеозиды и нуклеотиды
- •Биодетергенты и биокосметика
- •Микробные полисахариды
- •Биоматериалы
- •Биотрансформация
- •Биотрансформация стероидов
- •Ферменты
- •Ферменты
- •Ферментативный катализ
- •Ферменты в клинических анализах
- •Тесты с помощью ферментов
- •Применение ферментов в промышленных технологиях
- •Ферменты в производстве моющих средств
- •Ферменты, расщепляющие крахмал
- •Ферментативное расщепление крахмала в промышленности
- •Ферментативное превращение сахаров
- •Утилизация целлюлозы и полиозы
- •Использование ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности
- •Пектиназы
- •Ферменты в производстве молочных продуктов
- •Использование ферментов в хлебобулочной и мясоперерабатывающей промышленности
- •Ферменты в кожевенной и текстильной промышленности
- •Перспективы получения ферментов для промышленных технологий
- •Белковая инженерия
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Пекарские и кормовые дрожжи
- •Белки и жиры из одноклеточных организмов
- •Аэробная очистка сточных вод
- •Анаэробная очистка сточных вод и переработка ила
- •Биологическая очистка газовых выбросов
- •Биологическая очистка почв
- •Микробиологическое выщелачивание руд и биокоррозия
- •Инсулин
- •Гормон роста и другие гормоны
- •Гемоглобин, сывороточный альбумин и лактоферрин
- •Факторы свертывания крови
- •Антикоагулянты и тромболитики
- •Ингибиторы ферментов
- •Иммунная система
- •Стволовые клетки
- •Тканевая инженерия
- •Интерфероны
- •Интерлейкины
- •Эритропоэтин и другие факторы роста
- •Другие белки, имеющие медицинское значение
- •Вакцины
- •Рекомбинантные вакцины
- •Антитела
- •Моноклональные антитела
- •Рекомбинантные и каталитические антитела
- •Методы иммуноанализа
- •Биосенсоры
- •Биотехнология в сельском хозяйстве
- •Животноводство
- •Перенос эмбрионов и клонирование животных
- •Картирование генов
- •Трансгенные животные
- •Генетическая ферма и ксенотрансплантация
- •Растениеводство
- •Культивирование растительных клеток: поверхностные культуры
- •Культивирование растительных клеток: суспензионные культуры
- •Трансгенные растения: методы получения
- •Трансгенные растения
- •Вирусы
- •Бактериофаги
- •Микроорганизмы
- •Бактерии
- •Некоторые бактерии, важные для биотехнологии
- •Грибы
- •Дрожжи
- •Усовершенствование штаммов микроорганизмов
- •Основы биотехнологических методов
- •Микроорганизмы: рост в искусственных условиях
- •Кинетика образования продуктов метаболизма и биомассы в культуре микроорганизмов
- •Технология ферментации
- •Промышленные процессы ферментации
- •Культивирование животных клеток
- •Биореакторы для культивирования животных клеток
- •Биореакторы с иммобилизованными ферментами и клетками
- •Очистка биотехнологических продуктов
- •Очистка биотехнологических продуктов: хроматографические методы
- •Экономические аспекты биотехнологического производства
- •Методы генетической инженерии
- •Структура ДНК
- •Функции ДНК
- •Эксперимент в генетической инженерии
- •Методы выделения ДНК
- •Ферменты, модифицирующие ДНК
- •ПЦР: лабораторная практика
- •ДНК: химический синтез и определение размера молекул
- •Секвенирование ДНК
- •Введение ДНК в живые клетки (трансформация)
- •Идентификация и клонирование генов
- •Экспрессия генов
- •Выключение генов
- •Геном прокариот
- •Геном эукариот
- •Геном человека
- •Функциональный анализ генома человека
- •ДНК-анализ
- •Белковые и ДНК-чипы
- •Маркерные группы
- •Тенденции развития
- •Генная терапия
- •Поиск биологически активных веществ
- •Протеомика
- •Обмен веществ
- •Метаболомика и метаболическая инженерия
- •Системная биология
- •«Белая» биотехнология
- •Сертификация биотехнологической продукции
- •Этические аспекты генетической инженерии
- •Патентование в биотехнологии
- •Биотехнология в разных странах
- •Биотехнология в разных странах
- •Литература
- •Источники иллюстраций
- •Указатель микроорганизмов
Биотехнология в сельском хозяйстве
Животноводство
ВВЕДЕНИЕ. Со времен неолита уже почти 11 000 лет человек приручал собак, овец и коз, около 8 000 лет – коров и свиней. Основной задачей тогда было приручение и увеличение численности этих животных, в настоящее же время задача животноводства – дать человеку высококачественные продукты питания (мясо, молоко, яйца) и сырье для изготовления одежды (шерсть). За последние 30 лет производительность мясных коров, которая составляла 300 кг на животное в год и молочных коров – 10 000 л молока на животное в год, увеличилась почти вдвое. Еще с древности человек занимался скрещиванием видов и селекцией с целью изменения фенотипических признаков диких видов. В современном животноводстве наряду с классическими методами популяционной генетики и методов биометрического анализа используются такие био- и генно-инженерные подходы, как искусственное осеменение, оплодотворение in vitro (IVF) и перенос зародышей, построение генетических карт. Однако до сих пор трансгенные и клонированные животные используются только в исследовательских целях, но не в практическом животноводстве.
ИСКУССТВЕННОЕ ОСЕМЕНЕНИЕ. Первое упоминание об искусственном осеменении в собаководстве относится к 1729 г. В 1942 г. в Германии появилась первая станция искусственного осеменения крупного рогатого скота. Это относительно дешевый метод; прежде всего проводят отбор мужских особей с наилучшими качествами. Из эякулята одного быка можно получить 400 порций спермы, в каждой по 20 млн сперматозоидов. Смесь спермы с антифризными добавками подвергают глубокому охлаждению при –196 °С и хранят. Отбор производителей начинают с молодняка, прошедшего предварительный контроль по прибавке веса, молочности материнской линии, форме тела и качеству спермы. За период отбора, который длится примерно 4 года, определяется молочно-мясной потенциал будущего поколения (производительность потомства). Один донор спермы может заменить примерно 1000 быков. Оплодотворение женских особей размороженной спермой осуществляется ветеринаром, специалистом по оплодотворению или животноводом непосредственно на ферме. В развитых странах около 90% молочных коров осеменяется искусственным путем. У свиней искусственному осеменению подвергаются около 60% свиноматок.
ОПЛОДОТВОРЕНИЕ IN VITRO (IVF) И ПЕРЕНОС ЭМБРИОНОВ (ET) используется для повышения темпов размножения женских особей животных с ценными признаками. Метод переноса эмбрионов заключа-
ется в том, что с помощью введения гормонов стимулируют суперовуляцию у самок и осуществляют их искусственное оплодотворение. При этом можно получить до восьми эмбрионов, пригодных к пересадке; из них после пересадки в ложнобеременную суррогатную мать развивается в среднем четыре теленка. Эта процедура весьма дорогостоящая, поэтому она используется только для животных, представляющих особый интерес для сельского хозяйства. Широко применяется также оплодотворение яйцеклеток вне женских половых путей: для этого используют специальные методы культивирования и хранения полученных таким образом эмбрионов. У коров яйцеклетку изымают путем бескровной операции, у других животных (овец и свиней) – при обычном оперативном вмешательстве. Через 3–6 часов уже можно определить пол эмбрионов методом ПЦР. У коров оплодотворение in vitro широко используется на практике: отобранные по полу эмбрионы поступают в продажу, и могут быть перенесены в суррогатную мать.
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ. Долгое время ведутся работы по получению генетических карт домашних животных, прежде всего отвечающих за ценные для сельского хозяйства признаки. Для моногенных признаков (обусловленных одним геном) наследование можно проследить при помощи ПЦР и ПДРФ*. Примером важного моногенного признака является устойчивость к стрессу, обусловленная рианодиновым рецептором у свиней, и признаки, обусловленные различными генами, кодирующими белки молока у коров. Однако чаще всего ценные признаки являются полигенными, так что анализ их наследования затруднен.
|
|
|
162 |
* ПДРФ – полиморфизм длины рестриктных фрагментов. |
История животноводства |
|
|
|
|
Клонированные животные |
||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
Грегор Мендель, |
|
Трансгенные животные |
|
|||
|
|
|
|
|
Чарльз Дарвин |
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
Генетические карты (ДНК-маркеры) |
|
|||
|
|
|
|
|
|
Генетические карты (белковые маркеры) |
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
Генетичес- |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
кие маркеры |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Искусственное |
Перенос |
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
осеменение |
эмбрионов |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
у коров |
|
|
|
–12000 |
–10000 |
–8000 |
–6000 |
–4000 |
–2000 |
1900 |
1920 |
1940 |
1960 |
1980 |
2000 |
Биотехнологические методы разведения сельскохозяйственных животных |
|
|
|||||||||
|
ДНК-конструкция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ооцит |
|
Оплодотворение in vitro |
Эмбриональная |
||||
|
|
|
|
|
|
культура |
|
||||
|
|
|
|
|
Перенос |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
эмбриона |
|
|
|
|
|
|
|
Суперовуляция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Получение спермы, искус- |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
ственное оплодотворение |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
Суррогатная мать |
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Родоначальник линии |
||
Комбинация биотехнологических и традиционных методов |
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
Группа сельскохозяйственных животных |
|
|
|
|||||
Картирование |
|
|
Выявление различий |
|
Сравнение |
|
|
||||
генов |
|
|
|
между признаками |
|
с другими видами |
|
||||
|
Анализ сцепления |
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
Характеристика |
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
ответственного гена |
|
|
|
|
|
||
|
|
Генная диагностика |
|
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Традиционная |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
оценка |
|
|
|
Отбор на основе маркеров |
|
|
Перенос генов |
с/х ценности |
|||||
|
|
|
|
|
Биологическое |
|
|
|
|
|
|
Биотехнологические |
|
|
размножение |
|
|
|
|
|
|||
методы |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Традиционные |
Сельскохозяйственное животное с улучшенными признаками |
|
|
|
|||||||
методы |
|
|
163 |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Биотехнология в сельском хозяйстве
Перенос эмбрионов и клонирование животных
ВВЕДЕНИЕ. Остановимся отдельно на методах суперовуляции и культивирования эмбрионов, переноса эмбрионов в суррогатную мать для получения клонированных или трансгенных эмбрионов и получения клонированных животных.
ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.
Яйцеклетка млекопитающих после метафазы второго деления высвобождается из яйцевода в виде ооцита II. Затем происходит слияние яйцеклетки со сперматозоидом и оплодотворение, образуется второе полярное тельце. И в материнском, и в отцовском гаплоидном пронуклеусе происходит удвоение ДНК, после чего пронуклеусы сливаются с образованием диплоидного ядра зиготы; образуется первая разделительная бороздка. В результате последующих делений вплоть до образования морулы клеточное ядро увеличивается в размерах. На стадии морулы начинается первая дифференцировка клеток в бластоцисты. Это происходит в матке после растворения внеклеточной оболочки яйцеклетки (zona pellucida), и возникает эмбрион (зародыш).
СУПЕРОВУЛЯЦИЯ И ВЫРАЩИВАНИЕ ЭМБРИОНОВ.
У большинства видов животных количество эмбрионов можно увеличить путем введения самке гормонов (суперовуляция). Существует и другой подход: можно выделить яйцеклетку, оплодотворить ее in vitro (IVF) и, культивируя в соответствующей питательной среде в лабораторных условиях (ex vivo), вырастить до эмбриона. По экономическим соображениям такие эксперименты проводятся в основном только с эмбрионами коров и овец; известно, что эмбрионы этих животных сохраняются при –196 °С практически неограниченное время (криоконсервация).
ПЕРЕНОС ЭМБРИОНОВ. Под термином «перенос эмбрионов» понимают пересадку эмбрионов животного суррогатной матери того же биологического вида. Эмбрионы могут быть получены путем суперовуляции, или искусственного оплодотворения, животных-доно- ров. При клонировании эмбрионов из морулы микрохирургическими методами выделяют несколько бластомеров, которые после переноса в суррогатную мать развиваются в генетически идентичных животных. От одной коровы можно получить от 6 до 20 пригодных к переносу эмбрионов, которые примерно в 50% случаев будут успешно выношены. Широкого практического применения методы переноса эмбрионов пока не находят.
чужеродные гены (функциональное замещение). Полученные трансгенные эмбрионы переносят в суррогатную мать и получают таким путем трансгенных животных. Первые работы в этой области проводились на мышах – основных модельных организмах, которые используются при проведении фундаментальных исследований, а также при испытаниях фармацевтических препаратов. Этот метод со временем может также найти применение и при разведении сельскохозяйственных животных с ценными признаками и, возможно, заложит основы концепции генетической фермы.
КЛОНИРОВАННЫЕ ЖИВОТНЫЕ. Бесполый способ размножения широко распространен среди одноклеточных, растений и низших животных. У высших животных идентичные клоны встречаются в естественных условиях очень редко – в случае гомозиготных (однояйцевых) близнецов (среди людей частота встречаемости 0,3%). Для искусственного получения клонов животных у одного животного берут яйцеклетку (с гаплоидным набором хромосом) и удаляют ядро при помощи микропипетки. В соматических клетках этого же животного (например, в культуре клеток эпителия вымени) индуцируют G0-фазу, в которой не происходит деления клеток, после чего одна клетка на стадии G0-фазы (диплоидный набор хромосом) сливается с безъядерной яйцеклеткой. Полученную яйцеклетку можно подрастить в культуре клеток или в яйцеводе стерилизованной матери до развития эмбриона, после чего эмбрион переносят в организм суррогатной матери для вынашивания. В 1997 г. ученым впервые удалось получить клон (т. е. животное, генетически идентичное донору) из одной диплоидной соматической клетки взрослой особи. Клонированная овца Долли – единственный выношенный ягненок из 29 развившихся эмбрионов, полученных из 277 безъядерных яйцеклеток. С тех пор метод был успешно применен на мышах, козах, свиньях и коровах, и в дальнейшем он может быть использован прежде всего для создания продуктивного стада крупного рогатого скота молочной породы (генетическая ферма).
ТРАНСГЕННЫЕ ЭМБРИОНЫ. На стадии ооцита или бластоцисты в пронуклеус или в эмбриональные стволовые клетки можно ввести синтетические генетические конструкции. Наиболее часто эту процедуру осуществляют при помощи микроинъекций. Введение гетерологичной ДНК позволяет выключать некоторые
164 собственные гены (knock-out) или экспрессировать
Регуляция цикла и суперовуляция |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
Метод получения |
|
Эффект |
|
|
|
|||
Простагландин PGF24 |
|
Химический синтез |
|
Атрофия желтого тела вызывает течку |
||||||||
Фолликулостимулирующий |
|
Из гипофиза свиней |
|
Стимуляция фолликулов приводит |
||||||||
гормон (ФГС, или англ. FSH) |
|
или рекомбинантный |
|
к суперовуляции |
|
|
|
|||||
Гонадотропин сыворотки |
|
Из сыворотки крови |
|
Стимуляция фолликулов вызывает течку |
||||||||
крови жеребой кобылы (PMSG)* |
жеребой кобылы |
|
и приводит к суперовуляции |
|
||||||||
Гонадотропин-высвобождающий |
Химический синтез |
|
Индуцирует овуляцию |
|
|
|||||||
гормон (ГнТРФ, или англ. GnRH) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
* Другое сокращение eCG (от англ. equine choryogonadotropin – хориогонадотропин лошади) |
|
|
|
|||||||||
Развитие эмбриона млекопитающих и биотехнология |
|
|
Время, |
|
|
|||||||
Искусственное |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
Пример: Мышь |
Яичник |
сут |
|
|
||||
оплодотворение |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
|
Сперматозоиды |
|
|
|
Воронка яйцевода |
0,5 |
Введение |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
|
Полярное |
|
Оплодо- |
|
|
|
|
|
ГнТ человека |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
Внекле- |
|
тельце |
|
творение |
|
Увеличенная |
|
|
|
Овуляция/ |
||
|
Метафазное |
in vitro |
|
ампула |
|
|
|
|
оплодотворение |
|||
точная |
|
|
|
|
|
|
|
|||||
|
веретено |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
оболочка |
|
|
|
|
|
|
|
|
0,5 |
Вагинальная пробка, |
||
|
|
|
Много |
|
|
|
|
|
||||
яйцеклетки |
Ооцит |
|
|
|
|
|
|
Сперма- |
|
одна клетка |
||
|
|
|
ооцитов: |
|
|
|
|
|
Стадия двух клеток |
|||
|
|
|
|
суперову- |
|
|
|
|
тозоиды |
|
||
|
|
|
|
ляция |
|
|
|
|
|
|
(бластомеров) |
|
Мужской |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
1,5 |
|
|
пронуклеус |
|
|
|
Микро- |
|
|
|
|
Яйцевод |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Стадия |
|
||
|
|
Женский |
|
инъекция |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Фаллопиевы |
|
|
|
|
четырех клеток |
|||
|
|
пронуклеус |
генной |
|
|
|
|
2,5 |
Стадия |
|
||
|
|
|
|
конструкции |
(маточные) |
|
|
|
|
|||
Оплодотворенная |
|
|
|
|
|
восьми клеток |
||||||
|
|
|
трубы |
|
|
|
|
|||||
|
|
|
|
|
|
|
Стадия морулы |
|||||
яйцеклетка |
|
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Бласто- |
3,5 |
Бластоцисты |
|
|
|
|
|
Опреде- |
|
|
|
|
цисты |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ление |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
пола |
|
|
|
|
|
4,5 |
Внедрение |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Зигота (2n/4С) |
|
|
|
Матка |
|
|
|
|
в матку |
|
||
|
|
|
|
|
|
Трофобласт |
|
|
Культивирование |
|||
|
|
|
|
|
|
Эмбриобласт |
|
|
и хранение |
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
Зачатки |
|
|
|
Перенос эмбрионов |
||
|
|
|
|
|
|
эндодермы |
|
|
||||
Стадия двух клеток |
Морула |
Бластоциста |
|
|
|
|
в суррогатную мать |
|||||
|
|
|
|
|
|
|||||||
Клонирование животных |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
Удаление |
|
|
|
|
|
|
|
Культура |
|
|
|
|
полярного тельца |
|
|
|
|
|
|
эмбриональных |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
клеток |
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Перенос |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ооцит |
ядра |
|
|
Электрослияние |
Бластоциста |
Эмбрион |
Суррогатная |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
мать |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Культура |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
клеток |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Морула, бластоциста, |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
клетки зародыша или клетки |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
взрослого животного |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
165 |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|