инженерии

Маркерные группы

ВВЕДЕНИЕ. Маркерные молекулы имеют важное зна-

чение в фундаментальных исследованиях и приклад-

генетической

ной биотехнологии. Их используют: 1) при гисто- и

цитохимическом изучении клеток; 2) при отборе не-

обходимых клеток в клеточном анализаторе; 3) для

визуализации комплексов, например, с ДНК или с

антителами; 4) в генетической инженерии – при кло-

нировании промоторов. Для мечения используют ра-

диоактивные изотопы, флуорофоры, ферменты, ди-

Методы

гоксигениновую

или биотин-стрептавидиновую

систему, а в качестве генетических маркеров исполь-

зуют гены β-галактозидазы, люциферазы или GFP

(зеленого флуоресцентного белка).

РАДИОАКТИВНОЕ

МЕЧЕНИЕ. Для радиоиммуного

анализа белки метят с помощью 131I или 35S, а де-

тектирование осуществляют на сцинтилляционном

счетчике. В генетической инженерии в ДНКили

РНК-зонды вводят 32Р-фосфатные группы, используя

ДНК-полимеразу I, фрагмент Клёнова или РНК-поли-

меразу. Результаты гибридизации меченых фрагмен-

тов наблюдают с помощью авторадиографа. Соблю-

дение техники безопасности при работе с

радиоактивными изотопами сопряжено с финансо-

выми затратами. Несмотря на это, радиоактивное

мечение чаще всего используется благодаря высокой

чувствительности методов детекции. Поиск новых

меток и подходящих быстрых методов детекции про-

должается

ФЛУОРОФОРЫ. Использование таких флуорофоров,

как флуоресцеин или родамин, позволяет обнаружи-

вать вещества в пикомолярных концентрациях. В ги-

сто- и цитохимических исследованиях особенно ши-

рокое применение находят меченные флуорофорами

антитела. В клеточном анализаторе FACS за одну ми-

нуту можно отделить до 1000 клеток, несущих флу-

оресцентный маркер. Примером использования этого

метода в клеточной биологии является разделение

различных типов Т- и В-клеток, имеющих на своей

поверхности специфические антитела. Другой при-

мер применения флуорофоров – поиск в смеси бак-

терий тех, чья 16S-рРНК гибридизуется со специфи-

ческим меченым зондом (FISH). Флуоресцентными

маркерами для ДНК являются SYBR-GreenTM и бро-

мистый этидий.

ФЕРМЕНТЫ. Преимущества ферментных меток об-

условлены их мощной каталитической активностью,

благодаря которой достигается высокая чувствитель-

ность при многократном усилении сигнала. Это важ-

но при проведении анализов. Часто в качестве мар-

керов используются кислая фосфатаза и

пероксидаза хрена. Реакции, катализируемые этими

ферментами, можно изучать электрохимическими

266

(биосенсоры), фотометрическим, а также особенно

чувствительным хемилюминесцентным или флуорес-