Белковая инженерия

1)изучения механизма ферментативной реакции;

2)изменения субстратной или антигенной специфичности белка; 3) создания белка с новыми свойствами (температурная и рН-стабильность, устойчивость к действию протеиназ, растворимость, аллергенные свойства). Для этого в белке с известной аминокислотной последовательностью осуществляют направленную замену определенной аминокислоты. Такой подход называется рациональным дизайном. Отбор среди множества белков, полученных в результате случайного мутагенеза, тех, которые обладают определенными свойствами, называется направленной эволюцией.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ. Оба метода – рациональный дизайн и направленная эволюция – предполагают внесение мутаций в ген исследуемого белка и последующую экспрессию мутантных форм. Информацию о том, какую аминокислоту следует изменить, в случае белковой инженерии получают из структуры белка (например, рентгеноструктурного анализа кристалла белка или ЯМР-исследования) или структурных моделей, полученных методами биоинформатики из сравнения с гомологичными белками с известной пространственной структурой.

МУТАГЕНЕЗ. В современных исследованиях с целью делеции определенной аминокислоты или ее замены используется метод ПЦР. Разработаны многочисленные методики, позволяющие достаточно быстро и воспроизводимо осуществлять модификации белка. Для проведения случайного мутагенеза ген в составе вектора вносят в клетки штамма E. coli, в котором нарушена система репарации ДНК, и затем культивируют клетки в условиях, вызывающих мутации. Другой способ введения случайных мутаций заключается в изменении условий реакции ПЦР (например, добавление ионов Mn2+), приводящих к увеличению вероятности ошибок при амплификации ДНК до 1–3%. Метод gene shuffling основан на том, что гомологичный ген (>80% идентичных оснований) ферментативным путем расщепляют на небольшие фрагменты, а затем мутации вносятся в ходе ПЦР как результат случайной (статистической) рекомбинации.

РАЦИОНАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН. Информацию о пространственной структуре белка получают из данных рентгеноструктурного или ЯМР-анализа. К середине 2005 г. данные о пространственной структуре почти 30 000 белков были размещены в базе данных (Protein DataBase, PDB). Когда таких данных нет, то ис-

106 пользуют компьютерные банки данных: если имеется

белок с известной структурой, более чем на 30% гомологичный исследуемому, можно предсказать структуру исследуемого белка (молекулярное моделирование). Еще недавно подобное моделирование было доступно лишь в виде приближенных расчетов для условий вакуума. С использованием современных суперкомпьютеров и расчетных систем становится возможным предсказание структуры белка, особенностей его взаимодействия с субстратом или антигенами в водном растворе. Расчеты молекулярных механизмов зачастую требуют обработки данных о десятках тысяч атомов одновременно. Данные, полученные с применением такой «in silico»-методики, всегда должны контролироваться в ходе многократных циклов моделирования и в генноинженерных экспериментах («цикл белковой инженерии»).

НАПРАВЛЕННАЯ ЭВОЛЮЦИЯ. В отличие от рационального белкового дизайна для осуществления направленной эволюции не нужно знать структуру белка. В ген исследуемого белка (фермента) случайным образом вносят мутации, а затем с помощью быстрого функционального теста из образовавшихся форм белка выбирают те, которые обладают улучшенными свойствами, например повышенной активностью. Метод phage display позволяет быстро анализировать способность большого количества мутантных белков (1010) связываться с другими веществами, прежде всего с антителами. В обоих случаях решающую роль играет качество чипов. В последнее время методы направленной эволюции позволили достичь значительных успехов в оптимизации ферментов, используемых в промышленности. Стало возможным менять субстратную специфичность белков, их термостабильность и устойчивость в спиртовых растворах. Для скрининга большого количества мутантов разработаны автоматические многоканальные системы.