Список литературы

1. Авцын, А.П. Микроэлементы человека / А.П. Авцын, Л.С. Страчкова. М.: Медицина, 1991. - С.37-43.

2. Ахмадеев, А.Н. Ветеринарная экология / А.Н. Ахмадеев, И.М. Колесников, Лысов, В.Ф. и др.; под ред. Д.Н. Уразаева, В.И. Трухачева. М.: Колос, 2002. – С. 240.

3. Долгов, И.А. Микрофауна рубца и ее роль в питании животных // Сельскохозяйственные животные: физиологические и биохимические параметры организма: справочное пособие / И.А. Долгов, С.И. Долгова / под ред. В.Б. Решетов. – Боровск, 2002. – С. 50–71.

УДК: 619:57.083.3:577.17-035.5

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СХЕМ ИММУНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ СПЕЦИФИЧНЫХ К ЭСТРАДИОЛУ 17β Умаров А.Б., Абдрахманова Г.К., Садаев А.Р.

РГП «Костанайский государственный университет им. Ахмета Байтурсынова»,

г. Костанай, Республика Казахстан

В настоящее время при разработке различных диагностических наборов в качестве реагентных антител используются поликлональные антисыворотки, полученные путем иммунизации лабораторных животных. Основной показатель эффективности диагностических сывороток – титр специфических антител. В связи с этим изучение эффективных схем иммунизации лабораторных животных с целью получения антисывороток с высоким титром антител является весьма актуальным [3,4].

Целью настоящих исследований является получение антител специфичных к стероидному гормону эстрадиолу 17β с помощью различных схем иммунизации кроликов.

Исследования проводились в иммунобиологической лаборатории Инновационного научно-образовательного центра Костанайского государственного университета имени Ахмета Байтурсынова.

Материал и методы исследований

В работе были использованы следующие материалы:

- беспородные кролики весом 2-3 кг, самцы, возраст 4-6 месяцев;

- конъюгат эстрадиола с BSA (BSA – бычий сывороточный альбумин) производство (Китай);

- шприцы одноразовые, объем 2 мл;

- центрифуга низкоскоростная (Россия);

- одноразовая пластиковая лабораторная посуда;

- полный адъювант Фрейнда - ПАФ (Sigma, США);

- неполный адъювант Фрейнда - НАФ (Sigma, США);

- физиологический раствор;

- фосфатно-солевой буфер (ФСБ);

- фосфатно-солевой буфер с 0,05% содержанием твина-20 (ФСБ -Т);

- вошер (Проплан, Россия)

- спектрофотометр (Униплан, Россия).

Непрямой вариант иммуноферментного анализа (ИФА).

Ячейки 96-луночного планшета для иммунологических реакций

сенсибилизировали конъюгатом эстрадиола с ОVА (овабульмин) в концентрации 1мг/мл, при 40 ⁰ С в течение ночи. Для удаления несвязавшегося антигена планшет отмывали 3 раза ФСБ и 3 раза ФСБ -ТВ. Затем исследуемые сыворотки крови кроликов титровали и инкубировали при 37 ⁰ С в течение 60 минут. После инкубирования планшет отмывали описанным способом для удаления неспецифически связавшихся антител. Затем в лунки планшета вносили антивидовой конъюгат в объеме 0,1 мл и инкубировали при 37 ⁰ С в течение 60 минут. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции, и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат (однокомпонентный раствор тетраметилбензидина – ТМБ) вносили по 0,1 мл и инкубировали планшет 10-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшета раствора 0,5М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (Униплан, Россия) при длине волны 450 нм [1,9,10].

Реакция иммунодиффузии пометоду O. Ouchterlony (РИД).

На поверхность обезжиренных предметных стекол, расположенных на строго горизонтальной поверхности, наносили расплавленную 1% агарозу до образования слоя толщиной 1,5 мм. После застывания агара с помощью

специального трафарета и пробойника вырезали лунки диаметром 2-3 мм. В центральную лунку вносили 0,005 мл исследуемых конъюгатов, а в остальные – по 0,005 мл специфических антисывороток. Чашки Петри с предметными

стеклами инкубировали во влажной камере не менее суток при комнатной температуре. Результаты реакции учитывали по наличию полос преципитации между лунками с испытуемыми антигенами и специфическими иммунными сыворотками. Для контрастирования полос преципитации препарат окрашивали раствором Кумасси G–250 в течение 10-15 минут. Раствор красителя готовили следующим образом: 5г Кумасси растворяли в 1000 мл растворителя. Растворитель состоял из 450 мл дистиллированной воды, 450 мл этанола и 100 мл ледяной уксусной кислоты. После окрашивания геля проводили бесцвечивание раствором, состоящего из метилового спирта, уксусной кислоты и дистиллированной воды в соотношении 50:10:40 соответственно [5,8].

Результаты исследований

Специфические поликлональные антитела получали путем иммунизации лабораторных животных (кроликов) препаратами конъюгата эстрадиола с BSA. В проводимых исследованиях были выбраны две схемы иммунизации кроликов (таблица 1). В каждой схеме использовали трёх кроликов-самцов. До начала иммунизации у кроликов брали пробы крови для контроля иммунного статуса.

Схема №1 длительная в течение 75 дней с 5-кратным продолжительным введением препаратов конъюгата. Интервал между введениями 1-ой и 2-ой, а также 4-й и 5-й иммунизацией составил – 20 дней, между 2-й, 3-й и 4-й иммунизацией -10 дней. Продолжительность иммунизации кроликов по схеме №2 составила 42 дня с интервалом между 1-ой, 2-ой и 3-ей введениями – 7 дней, и последняя четвертая иммунизация проводилась через 14 дней. Отбор крови для анализов проводился на 42-й день после начала иммунизации.

В обеих схемах применяли препараты конъюгата эстрадиола с БСА в концентрации – 0,2 мг/мл с полным и неполным адъювантами Фрейнда в соотношении 1:1 [2,3,6,7].

Таблица 1 - Схемы иммунизации кроликов конъюгатом эстрадиола -BSA

Этапы иммуни зации	Схемы иммунизации
	1 – я	2 – я
1	В первый день введение 500мкл конъюгата с ПАФ в соотношении 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области	В первый день введение кроликам конъюгата 500 мкл в ПАФ 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области
2	На 20 день по 500 мкл конъюгата с НАФ 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области	На 7 день по 500 мкл конъюгата с НАФ в соотношении 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области
3	На 30 день по 500 мкл конъюгата с НАФ 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области	На 14 день по 500 мкл конъюгата с НАФ в соотношении 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области
4	На 40 день по 500 мкл конъюгата с НАФ 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области	На 28 день по 500 мкл конъюгата с НАФ в соотношении 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области
5	На 60 день по 500 мкл конъюгата с НАФ 1:1, подкожно в 5 точек парапозвоночной области	Отбор крови на 42-й день после начала иммунизации
6	Отбор крови на 75-й день после начала иммунизации	___

Оценку специфической активности иммунной сыворотки проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Для проверки стабильности специфичности проводили реакцию РИД против использованного гетерологичного конъюгата по классической методике. Результаты изучения активности кроличьих антисывороток специфичных к конъюгату эстрадиола с BSA представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Изучение активности кроличьих антисывороток, специфичных к конъюгату эстрадиола - BSA

Схема иммуни зации	Метод исследования
	ИФА	РИД
1	1:800-1:3200	1:2 – 1:4
2	1:400-1:1600	1:2

Как видно из таблицы 2, применяемый конъюгат эстрадиола с BSA обладал достаточно сильными иммуногенными свойствами. Результаты исследований показали, что с помощью двух схем иммунизации были получены иммунные сыворотки к конъюгату эстрадиола с BSA в ИФА с титрами 1:400-1:3200, в реакции иммунодиффузии линии преципитации между лунками с антигеном и антителами 1:2-1:4. Применение длительной схемы иммунизации №1 оказалось наиболее эффективным, титр в ИФА составил 1:800-1:3200, в РИД 1:2-1:4.

Выводы

В результате тестирования полученных сывороток крови было определено, что обе схемы иммунизации способствуют созданию стойкого иммунного ответа и образованию высокого титра антител в полученных антисыворотках. При этом наиболее высокий титр антител по отношению к эстрадиолу, показали пробы сывороток крови от кроликов иммунизированных по схеме №1 с 5-кратным, продолжительным введением препаратов в течение 75 дней. Титры антител, специфичных непосредственно к антигенным детерминантам гаптена - эстрадиола 17β были довольно высокими и находились в пределах 1:800-1:3200 в ИФА, полученный результат был подтвержден методом РИД и составил: 1-2, 1-4 титр антител. От животных с наиболее высоким титром специфичных антител были получены поликлональные специфические сыворотки.

Резюме

В статье представлены результаты изучения схем иммунизации кроликов конъюгатом эстрадиола - BSA. Установлено, что препарат конъюгата эстрадиола в концентрации 0,2 мг/мл применяемый в 4-х и 5-ти последовательных подкожных инъекциях в присутствии неполного адьюванта Фрейнда способен вызывать иммунный ответ у животного с максимальным титром специфических антител 1: 1:3200. Полученная специфичная иммунная сыворотка против гаптена – эстрадиола может применяться в качестве биологического сырья для конструирования набора иммунобиологических реагентов.