Список литературы

1. Fomin A. A., Steinhauer A.B., Lyasnikov V.N., Wenig S.B., Zakharevich A.M. Nanocrystalline structure of the surface layer of plasma-sprayed hydroxyapatite coatings obtained upon preliminary induction heat treatment of metal base // Technical Physics Letters, 2012. – Vol. 38. – № 5. – 481–483 p.

2. Анников В.В.. Анатомо-хирургические аспекты оптимизации репаративного остеогенеза в условиях внешней фиксации аппаратами стержневого типа : дис. …д-ра вет. наук 2006. – 365с.

3. Родионов И.В. Физико – химические основы технологии формирования электрохимических оксидных покрытий на изделиях медицинского назначения. Дис. …д-ра техн. наук.- С., 2011. - с.317.

4. Фазовый состав и коррозионное поведение биопокрытий чрескостных фиксаторов из стали 12X18H9T, полученных термическим оксидированием / И.В. Родионов, К.Г. Бутовский, В.В. Анников, Т.С. Хапрова // Сб. докладов 2-го междунар. научно-технич. симпозиума «Наноструктурные функциональные покрытия и материалы для промышленности» Харьковской нанотехнологической ассамблеи. Наноструктурные материалы. Украина, Харьков, 2007. - Т.1. - с.134-138.

5. Моделирование наружного чрескостного остеосинтеза /О.В.Бейдик и др.- Саратов, 2002.-198 с.

6. Родионов И.В., Анников В.В., Фомин А.А., Пигарева Ю.В., Корчагина И.Г. Потенциометрическое исследование коррозионной активности поверхности чрескостных остеофиксаторов из стали 12Х18Н9Т в модельной биокоррозионной среде // Приднепровский научный вестник. №12 (134), 2012. С. 36-45.

УДК 619:57.083.3:577.17-035.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К СТЕРОИДНЫМ ГОРМОНАМ Ирбатырова А.А., Бермухамедов Ж., Рыщанова Р.М.

РГП «Костанайский государственный университет

имени А. Байтурсынова»,

г.Костанай, Республика Казахстан

Актуальность

Изобретение технологии получения моноклональных антител (МКА) было отмечено в 1980 году прошлого столетия Нобелевской премией [1, 2]. Оно, прежде всего, явилось мощным инструментом для научных исследований в области биологии, иммунологии, медицины и ветеринарии, открыло широкие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств[3, 4,5].

Преимуществом МКА является строгая направленность к одной антигенной детерминанте, постоянный аффинитет и физико-химические характеристики, возможность наработки препарата в неограниченном количестве [6,7]. К настоящему времени получено громадное количество гибридом - продуцентов моноклональных антител к различным антигенам, что и позволило создать диагностические иммунологические тест-системы, отличающиеся высокой специфичностью и чувствительностью.

Цель и задачи

Были предприняты попытки получить штаммы гибридных клеток продуцирующих моноклональные антитела специфичных антигенным детерминантам эстрадиола.

Работа проводилась в Научно-исследовательском институте биотехнологии АО «Казахский агротехнический университет имени С. Сейфуллина».

Материал и методы

В работе использовались лабораторные животные: беспородные мыши, мыши линии BALB/c. Химические и биологические препараты: эстрадиол (Китай), бычий сывороточный альбумин (БСA) (IgG-Free, Protease-Free) производства Jackson Immuno Research (США), хлористоводородны 1–этил 3 (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) (Sigma-Aidrich, США), пероксидаза хрена «Sigma (Тип VI, лиофилизированный, 250-330 ед/мг, RZ-3.0), среда RРМI 1640 (Sigma, США), Кумасси G-250, этиловый спирт 96º, сыворотка плода коровы фирм Hy Clon (США), пируват натрия, 7,5 % бикарбонат натрия, Hepes, L-глютамина, 2-меркаптоэтанол, пристан и реактивы для проведения иммуноферментного анализа. Для работы по получению гибридом использовали специальную стерильную пластиковую посуду для культуры клеток: чашки Петри, 96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с площадью роста 25, 75 см² .

При проведении исследований применялись серологические, иммунохимические, биотехнологические методы.

Иммунизация мышей линии Balb/c в количестве 3 головы препаратом конъюгата эстрадиола с бычьим сывороточным альбумином (эстрадиол-БСА). Мышей иммунизировали по схеме: в первый день иммунизации вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг антигена в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда (SIGMA, США). Затем на 7, 11, 12, 13 дни иммунизации животным инъецировали по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе, рН 7,2.

Гибридизация Для работы по получению гибридом готовили культуральную среду из компонентов: среда RPMI-1640 (Sigma, США), пируват натрия (Sigma, США); бикарбонат натрия; Hepes (Sigma, США); L-глютамин (Sigma, США); 2- меркаптоэтанол (Ferak, Германия), дистиллированная вода. С помощью NaOH рН среды доводили до 7,2 –7,4 и стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры 0,22 мкм (''Millipore'', США). Полную ростовую среду для культивирования гибридных клеток готовили добавлением в неполную ростовую среду 10 % к объему среды стерильной сыворотки плода коровы (Sigma, США), инактивированной нагреванием при 56 ºС в течение 30 минут.

Для гибридизации использовали миеломные линии клеток Х₆₃–Ag 8.653, которые перед слиянием размораживали в водяной бане при 37 ºС, и переносили в пробирку с 10 мл холодной неполной ростовой среды. Инкубировали клетки при 37 С в атмосфере с 5 % СО₂. Для гибридизации использовали клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста. Клетки переносили из культуральных сосудов в центрифужные пробирки и центрифугировали 5-7 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок суспензировали в 5 мл неполной ростовой среды и подсчитывали количество клеток в камере Горяева [7].

За 3 дня до слияния клеток, в стерильных условиях выделяли перитонеальные макрофаги беспородных мышей и высевали их в ячейки 96-луночных планшет. Клетки выращивали в СО₂–инкубаторе при температуре 37 С в атмосфере с 5% СО₂.

Гибридизацию клеток миеломных линий X₆₃ Ag 8.653 [8,9,10] со спленоцитами иммунизированных мышей проводили в стерильных условиях в ламинарном шкафу (Telstar, Испания) по стандартной методике [11, 12]. Колонии растущих клеток определяли микроскопически. Антительную активность клеток-субклонов определяли с помощью твердофазного ИФА на 10–14 сутки после клонирования. На всех этапах клонирования гибридные клетки параллельно размножали в небольших количествах (4-5 лунок) на 24–х луночных планшетах («Nunc», Дания) и криоконсервировали в морозильнике – 70 ⁰ С.

Постановка конкурентного варианта ИФА проводилась по стандартной методике [13, 14]. Лунки планшета сенсибилизировали специфическими моноклональными антителами в концентрации 0,005 мг/мл на карбонат бикарбонатном буфере (рН 9,5), при 4º С в течение ночи. Для удаления несвязанных антител планшет отмывали 3 раза фосфатно-солевым буфером с содержанием 0,05% твина-20 (ФСБ-ТВ). Далее в лунки планшета вносили по 0,05 мл стандартных растворов гормона (с концентрациями: 0; 0,5; 1,5; 4,5; 13,5; 40,5 нг/мл). Добавляли по 0,05 мл раствора конъюгата в рабочем разведении. Добавляли по 0,05 мл раствора вторичных антивидовых антител, перемешивали вручную, легкими круговыми движениями по поверхности стола и инкубировали в течение 2-х часов при комнатной температуре в пределах 20-25 °С. Повторяли процедуру отмывки для удаления несвязанных продуктов реакции и в лунки вносили по 0,1 мл раствора субстрата фермента. Субстрат (однокомпонентный раствор тетраметилбензидина – ТМБ) вносили по 100 мкл и инкубировали планшет 10-15 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением в лунки планшета раствора 0,5М серной кислоты. Результаты ИФА учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным потоком света (ASYS Expert 96, Австрия) при длине волны 450 нм. Реакция ставилась в двух повторах.

Определение белка по методу Брэдфорд. Раствор готовили следующим образом: 100 мг кумасси растворяли в 50 мл этанола, добавляли 100 мл 85% Н₃РО₄, остужали, доводили до 1 литра дистиллированной водой. В лунку первого ряда вносили по 100 мкл пробы белка неизвестной концентрации и бычий сывороточный альбумин в концентрации 1 мг/мл в качестве контроля. В лунки следующих рядов вносили по 50 мкл ЗФР (рН 7,2-7,4). Опытные и контрольные пробы белка раститровывали в объеме 50 мкл. В каждую лунку вносили по 50 мкл реактива Бредфорда и учитывали результат на спектрофотометре при длине волны 492 нм

Буферные растворы готовили по стандартным прописям.

Результаты исследований

С целью получения гибридных культивируемых клеток продуцентов моноклональных антител к эстрадиолу проведена иммунизация мышей линии Balb/c. Выбор экспериментального животного для иммунизации определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридных клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме данного вида животного [15, 16]. В результате тестирования полученных сывороток крови мышей было определено, что все препарат конъюгата эстрадиол-БСА обладает свойством вызывать иммунный ответ. Титры антител, специфичных непосредственно к антигенным детерминантам гаптена-гормона находились в пределах 1:1600. Для получения штаммов гибридом продуцирующих моноклональные антитела была проведена реконсервация иммунных спленоцитов полученых в результате иммунизации мышей конъюгатом эстрадиола с БСА. Проведено слияние спленоцитов с клетками миеломной линии Х63-Аg 8.6.5.3. В качестве сливающего агента использовали 50% раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 4000 [17, 18 , 19]. После гибридизации клетки культивировались на селективных средах ГТ (гипоксантин-тимедин) и ГАТ (гипоксантин-аминоптерин-тимидин). По истечению 14 суток культивирования под микроскопом было выявлено образование 12 клонов. Результаты первичного тестирования гибридных клонов в непрямом варианте иммуноферментного анализа показали присутствие специфических антител в культуральной жидкости 2-х штаммов гибридом. В качестве антигена для сенсибилизации использовали конъюгат эстрадиола с овальбумином (ОВА). Проводилась наработка препаративного количества моноклональных антител, продуцируемых этими штаммами методом in vitro на планшетах и матрацах.

Клетки гибридом были пересеяны на 24-луночный планшет, затем на матрац и по мере накопления подвергнуты криоконсервированию в жидком азоте. В результате получены гомогенные штаммы продуцирующие моноклональные антитела спецефичные к антигенным детерминантам эстрадиола. По мере накопления и перехода роста клеток в стадию логарифмического роста, гибридомы переносили и культивировали на полистироловых матрацах (объем – 50 мл). Культуральную жидкость содержащую моноклональные антитела тестировали в непрямом варианте иммуноферментного анализа, отбирали в отдельные стерильные флаконы и консервировали с помощью раствора азида натрия (до 0,003% концентрации). В результате было получено по 200 мл культуральной жидкости содержащей моноклональные антитела. Титр антител оставался на прежнем уровне и составил 1:1600-1: 3200. Концентрация белка, определенная методом Бредфорд была в диапазоне 60-125 мкг/мл.

Выводы

Проведена иммунизация лабораторных животных, получены моноклональные антитела, проведена серия гибридизаций иммунных спленоцитов с миеломными клетками, в результате которой получены штаммы, синтезирующие моноклональные антитела к антигенным детерминантам эстрадиола. Результаты исследований позволяют предположить возможность их использования в разработке иммунобиологических реагентов.

Резюме

В данной статье приведен опыт получения моноклональных антител к антигенным детерминантам эстрадиола, тестирование их на активность и специфичность. Гибридизация миеломных клеток со спленоцитами иммунизированных мышей. В результате гибридизации получены штаммы гибридных клеток продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам эстрадиола и создание клонов моноклональных антител методом in vitro. Проведена наработка препаративного количества моноклональных антител.