Связывание и функцияTfiiia

Сайты связывания TFIIIA в гене 5S-pPHK были определены с помощью мутационного анализа, картирования (футпринтинга) ДНКазой I, метилирования гуанозинов и блокирования фосфатов (Sakonju, Brown, 1982; Pieler et al., 1985). По результатам мутационного анализа были установлены три

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ___________________________________ 129

Рис. 11.27. Схема взаимодействия между TFIIIA и внутренней контролирующей областью соматического гена 5S-pPHK Xenopus. Гуанозиновые остатки, метилирование которых влияет на связывание TFIIIA помещены в прямоугольники серого цвета. Фосфатные группы в ДНК, которые контактируют с TFIIIA, указаны черными треугольниками; последовательности ДНК. защищенные белком TFIIIA от гидролиза ДНКазой 1, подчеркнуты. Основания, которые отличаются в ооцитном гене 5S-pPHK, приведены под цепью ДНК. (По Sakonju, Brown, 1982.)

участка, необходимые для правильной транскрипции: нуклеотиды в положениях 50-61, 70-71 и 80-89. Последовательность нуклеотидов 50-61 обнаружена во всех других генах, транскрибируемых РНК-полимеразой III. В этом консервативном участке соматический 5S-ген отличается от ооцитного 5S-гена, и это различие, как полагают, обеспечивает разное сродство этих двух генов к TFIIIA. «Футпринтинг» ДНКазой 1 осуществляется путем присоединения белка (в данном случае TFIIIA) к радиоактивной ДНК и последующего переваривания ДНК с помощью этой относительно неспецифической ДНКазы. Полученную ДНК вносят в гель и разделяют электрофорезом, как при секвенировании. При этом получают ожидаемую олигонуклеотидную «лестницу», характерную для секвенирующих гелей, где каждый олигонуклеотид на одно основание короче, чем олигонуклеотид, лежащий выше его. Однако в тех участках, где ДНК защищена белком от гидролиза ДНКазой, соответствующие олигонуклеотиды отсутствуют. Результат такого опыта в случае связывания TFIIIA с геном 5S-PHK из ооцита Xenopus представлен на рис. 11.26. Отчетливо видны три сайта связывания. Можно выяснить, меняется ли данный характер защиты нуклеотидов в ДНК при модификации остатков гуанозина (метилированием) или фосфатных групп (этилированием). Метилирование определенных групп гуанозинов (70 и 71; 80-89) и этилирование определенных групп фосфатов (70 и 71; 80-87) подавляет связывание TFIIIA и предотвращает защиту этим белком указанных участков ДНК. Эти данные суммированы на рис. 11.27; они выявляют три сайта связывания TFIIIA на гене 5S-PHK.

Если в SS-промоторе присутствуют три основных участка связывания TFIIIA, то в белке TFIIIA имеются девять доменов, связывающих ДНК. Каждый из этих «ДНК-связывающих пальцев» представляет собой глобулярный домен, в центре которого находятся преимущественно основные аминокислоты. Эти домены соединены друг с другом тандемно. и каждый стабилизирован ионом цинка, расположенным в центре домена (рис. 11.28). Предполагается, что такое строение позволяет TFIIIA удерживаться на гене при движении по нему РНК полимеразы (Miller et al., 1985). Если одни из связывающих доменов открепляются, то прикрепление к ДНК будут обеспечивать другие домены.

Какая из функций TFIIIA делает его необходимым для транскрипции? Группой исследователей (Kmiec, Worcel, 1985; Kmiec et al., 1986) было высказано предположение, что роль TFIIIA заключается

Рис. 11.28. Сопоставление структур белка – регулятора транскрипции TFIIIA и внутренней контролирующей области молекулы ДНК. А. Ориентация белка по отношению к ДНК. Девять «пальцев», связывающихся с SS-промотором, экспонированы. Б. Детальный вид ДНК-связывающих «пальцев», стабилизированных цинком; основные остатки (черные кружки) присоединяются к ДНК. (По Miller et al., 1985.)