Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

104____________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________

Рис. 10.32. Пуфы, индуцированные экдистероном. в культивируемых клетках слюнной железы D. melanogaster. Показан тот же участок хромосомы, что и на рис. 10.26. А. Цикл пуфинга. индуцированный экдистероном. I – неинкубированный контроль; // – V – хромосомы, стимулированные экдистероном соответственно через 25 мин. 1, 2 и 4 ч.· Б. Гибридизация радиоактивной РНК in situ показывает, что хромосомы из культивируемых клеток слюнной железы после стимулирования экдистероном транскрибируют РНК в специфических участках (74EF и 75В). (А – с любезного разрешения М. Ashburner; Б – по Bonner, Pardue, 1977.)

сомами слюнных желез с помощью гибридизации in situ. Гибридизация РНК с пуфами, индуцированными экдистероном, наблюдалась только в случае, если РНК была мечена в присутствии экдистерона (рис. 10.32. Б). Гибридизация с пуфами, подавляемыми экдистероном, проходила наилучшим образом, когда использовали РНК из тех желез, которые культивировали без экдистерона. Кроме того, РНК из имагинальных дисков, стимулированных экдистероном. не гибридизовалась со стимулированными экдистероном пуфами слюнных желез. Благодаря этому выяснилось, что эти пуфы являются тканеспецифичными, они меняются при изменении клеточной активности и в них синтезируются тканеспецифичные РНК.

Дифференциальная активность генов регулируется во времени и в пространстве. Для определения времени транскрипции определенных генов весьма ценными оказались клонированные гены. Сарджент и Дэвид (Sargent, Dawid, 1983) из зародышей Xenopus на стадии гаструлы выделили мРНК, которая отсутствовала в яйце. К этой мРНК были получены кДНК-копии. Эти кДНК из клеток гаструлы исследователи смешивали с избытком мРНК из ооцитов. Если мРНК ооцита гибридизуется с комплементарной ДНК гаструлы, то это означает, что данная кДНК получена для фракции мРНК, которая присутствует как в ооците, так и в зародыше на стадии гаструлы. Полученные двухцепочечные гибридные молекулы удаляли с помощью фильтрации, оставляя, таким образом, популяцию молекул кДНК, специфичных для гаструлы. Затем эти кДНК делали двухцепочечными (с помощью ДНК-полимеразы) и вводили в векторы для клонирования. Этот метод называют клонированием с вычитанием. Он позволяет получить стадиоспецифичную библиотеку клонов, мРНК для которых обнаруживается на одних стадиях и отсутствует на других (рис. 10.33).

Затем исследователи брали зародышей на разных стадиях развития от зиготы до головастика и для каждой стадии изолировали РНК. Эту РНК наносили в точки на нитроцеллюлозные фильтры так, чтобы на каждом фильтре была РНК со всех стадий. После того как РНК запекли на фильтре, одноцепочечную ДНК, полученную из отдельных клонов, метили радиоактивностью и инкубировали с фильтрами. В случае если ген транскрибируется на данной стадии, радиоактивная кДНК для этого гена