Сайты разветвления

Помимо сайтов сплайсинга существует еще одна последовательность, необходимая для правильного вырезания нитронов. Это сайт разветвления. Он расположен внутри интрона обычно на расстоянии около 20–50 нуклеотидов выше 3'-концевого сайта сплайсинга и имеет консенсусную последовательность УАУААЦ. В большинстве положений У может быть заменен на Ц, а А – на Г. Однако предпоследний (подчеркнутый) остаток А является незаменимым. Этот остаток А имеет ключевое значение,

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК___________________________________ 191

Таблица 13.3. Последовательности нуклеотидов в местах соединения кодирующих областей и промежуточных последовательностей ¹⁾

Организм	Ген и интрон	Кодирующая последовательность	Промежуточная последовательность	Кодирующая последовательность.
Источник: Lewin, 1980. 1) Представлены последовательности ДНК, гомологичные последовательностям РНК, с совмещенными сайтами соединения экзонов и интронов. Точное место сплайсинга указать нельзя, так как последние основания первой кодирующей области обычно повторены на правом конце интрона. В конце таблицы приведены консенсусные последовательности, общие для большинства границ экзон/интрон (АГ/ГТ) и соединений интрон/экзон (ΤΤNЦАГ).

поскольку он образует фосфодиэфирное «разветвление» с фосфатом 5’-концевого сайта сплайсинга (рис. 13.15). Он делает это, используя свою свободную 2'-гидроксильную группу для соединения с фосфатом из 5’-сайта сплайсинга. Таким образом, фосфат из ГМФ, вместо того чтобы удерживать первый экзон, высвобождает его и зацепляется за 2’-гидроксильную группу АМФ в сайте разветвления. В результате этого маневра высвобождается первый экзон и образуется «лариатная» (типа лассо) структура в качестве промежуточной.

Свободный 3'-ОН-конец первого экзона присоединяется затем к фосфату в 3'-сайте сплайсинга ниже петли лариата, благодаря чему первый экзон заменяет собой интрон. В результате происходит соединение двух экзонов с помощью группы АГ из первого экзона и Г из второго экзона (Sharp, 1987).

Промежуточный продукт, напоминающий по форме лассо, с 2'—5' фосфодиэфирной связью был обнаружен в опытах с клонированным фрагментом ß-глобинового гена человека, состоящим из первых двух экзонов и интрона между ними (Ruskin et al., 1984). РНК, транскрибированную с этого клона, добавляли в экстракт ядер из клеток человека, способный осуществлять сплайсинг этого «предшественника» по соответствующим сайтам (Krainer et al., 1984). Для завершения этой реакции in vitro требуется около часа, после чего можно изолировать промежуточные продукты с помощью гель-электрофореза (поскольку лариатная структура затрудняет миграцию при электрофорезе). Химический анализ этих промежуточных продуктов подтвердил, что нуклеотид А в сайте разветвления имеет две фосфодиэфирные связи, одну с участием 2-ОН-группы и одну с участием 3'-ОН-группы. Вскоре после этого были идентифицированы аналогичные промежуточные продукты ß-глобиновых транскриптов при процессинге in vivo в зародышах кролика (Zeitlin, Efstratiadis, 1984).