Гиперчувствительность к днКазе и характер метилирования

Во взаимоотношениях между сайтами, гиперчувствительными к ДНКазе, энхансерными элементами и сайтами метилирования легко запутаться. У курицы активность гена главного желточного белка вителлогенина II регулируется эстрогеном, и синтезируется этот белок только в печени кур-несушек. В генах вителлогенина, находящихся в хроматине печени, уже до стимуляции гормоном имеются четыре сайта, гиперчувствительные к ДНКазе I. Следовательно, они существуют прежде, чем в этом локусе начинается транскрипция (Burch, Weintraub, 1983). Эти гиперчувствительные сайты (указаны стрелками «А» на рис. 12.26. Г) находятся в середине и в 3'-фланкирующей области гена в хроматине печени, но отсутствуют в хроматине эритроцитов, фибробластов и нейронов. После стимуляции эстрогеном возникают три новых сайта, гиперчувствительных к ДНКазе I. Они лежат в 5'-фланкирующей области гена и связаны с энхансерными элементами, которые присоединяют рецептор эстрогена (Burch, Weintraub, 1983). Кроме того, расположенный в этой области ЦГ-сайт, который обычно метилирован у зародышей и у петухов, при добавлении эстрогена становится неметилированным (указан кружком на рис. 12.26). После удаления эстрогена один из 5'-чувствительных сайтов исчезает, хотя другие сайты (и характер деметилирования) сохраняются. Ни деметилирования, ни возникновения новых гиперчувствительных сайтов в гене вителлогенина в клетках других типов не наблюдается.

Высказано предположение, что деметилирование необходимо для появления сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе I (Keshet et al., 1986). Если неметилированные глобиновые гены трансфицировали в ядра фибробластов мыши, то в них обнаруживались сайты, чувствительные к ДНКазе (независимо от способности генов к транскрипции). Если же эти гены были метилированы по каждому ЦфГ-сайту, то чувствительные к ДНКазе участки не возникали.

Регуляция активности генов

Как могут существовать участки, гиперчувствительные к ДНКазе I, если ДНК единообразно упакована в нуклеосомы? На этот вопрос возможны два ответа. Первый в хроматине существуют области, свободные от нуклеосом, и второй – существуют факторы, которые присоединяются к нуклеосомам и заставляют их ослаблять связь с ДНК.

Отсутствие нуклеосом обеспечивает доступность всей ДНК в этой области для РНК-полимеразы и возможность осуществления эффективной транс-

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ___________________________ 165

Рис. 12.26. Корреляция транскрипции с гиперчувствительностью к ДНКазе I и гипометилированием в сайтах энхансеров. А. Определение гиперчувствительности к ДНКазе I при гидролизе хроматина печени через 0; 3; 4,5 и 8 ч после обработки эстрогеном. Левая дорожка для каждого времени соответствует негидролизованному хроматину. Появление новых коротких фрагментов через 8 ч после обработки эстрогеном указывает на расщепление ДНКазой соответствующих участков. Радиоактивный зонд свидетельствует о присутствии ДНК из 5’-конца гена. С, Β1 и В2 соответствуют сайтам гена, показанным на схеме Г. Б. Определение метилирования в ДНК печени в различные сроки после обработки гормоном. ДНК гидролизовали рестриктазой HpaII. В период до 8 ч зонд узнает ДНК в большом HpaII-фрагменте.· Через 8 ч появляется второй фрагмент. Это означает, что исходно метилированная последовательность ЦЦГГ в соответствующем участке стала неметилированной. В. Дот-блот-гибридизация цитоплазматической мРНК с кДНК-зондом для вителлогенина. Впервые транскрипция наблюдается приблизительно на 8-м часу. Г. Результаты опытов. Перед добавлением гормона в хроматине печени имеются три сайта, гиперчувствительных к ДНКазе I; в хроматине из других клеток не имеется ни одного гиперчувствительного сайта. Добавление гормона вызывает появление в клетках печени трех новых сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе I, на 5'-конце гена и гипометилирование этого участка (обозначено черным кружком). В клетках из других органов не наблюдается ни гипометилирования, ни гиперчувствительности к ДНКазе I. Удаление гормона приводит к исчезновению в хроматине печени одного гиперчувствительного сайта, специфичного для гормона, и к потере транскрипционной активности. (Из Burch,. Weintraub, 1983; фотография с любезного разрешения авторов.)

крипции. У клопа-наземника Oncopeltus fasciatus часть генома, содержащая гены рибосомной РНК, практически полностью свободна от нуклеосом и ДНК в этой области транскрибируется очень активно (Foe et al., 1976). Результаты электронно-микроскопических исследований подтвердили это наблюдение для Oncopeltus и некоторых других видов (рис. 12.27) (Labhart, Koller, 1982).

Транскрипция глобиновых генов мыши тоже может происходить с нарушениями в распределении