Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

210_______________ ГЛАВА 14_____________________________________________________

Рис. 14.15. Включение [3Н]-уридина в РНК зародышей дикого типа и мутантных зародышей. Зародышей на стадии бластулы инкубировали в присутствии радиоактивного предшественника РНК в течение 3 ч, отмывали от метки, фиксировали, окрашивали и визуализировали с помощью радиоавтографии. А. Клетки нормальных зародышей имеют высокую радиоактивность, что свидетельствует о синтезе РНК. Б. Зародыши, полученные от самок, имеющих генотип «0/0». Зародыши окрашиваются, но существенного мечения не наблюдается, что указывает на низкий уровень или полное отсутствие транскрипции. (Из Carroll, 1974.)

Характеристика материнских мРнк

Эрик Дэвидсон и его коллеги оценили сложность ооцитной мРНК методом, аналогичным использованному ими для анализа сложности яРНК (гл. 13). РНК в большом избытке гибридизовали с денатурированной ДНК; было обнаружено, что значение С_оt для 50%-ной гибридизации пропорционально количеству имеющихся различных РНК-последовательностей.

С помощью этого анализа они подсчитали, что каждый ооцит (у представителей самых разнообразных типов животных) имеет различные последовательности в количестве, достаточном для приблизительно 1600 копий каждой из 20 000 - 50 000 типов РНК (Galau et al., 1976; Hough-Evans et al., 1977). Из клеток всех известных типов мРНК ооцита характеризуется наибольшей сложностью, и эта сложность отражает огромный потенциал ооцита к развитию. Однако лишь немногие из этих мРНК охарактеризованы. Использование бесклеточных систем трансляции и кДНК-зондов позволило идентифицировать в цитоплазме ооцита мРНК гистонов (Skoultchi, Gross, 1973) и мРНК тубулина (Raff et al., 1972). Очевидно, что продукты этих мРНК важны для образования хроматина и митотического веретена при дроблении.

Биохимические методы позволили идентифицировать мРНК для рибонуклеотид-редуктазы (фермент, необходимый для образования дезоксирибонуклеотидов из запасенных рибонуклеотидов) и для фермента вылупления (фермент, который позволяет зародышам разрушать оболочки оплодотворения) (Raff, 1980). В ооцитах двустворчатых моллюсков рибонуклеотид-редуктаза запасается необычным образом. Большая субъединица накапливается в виде белка в цитоплазме ооцита, а малая субъединица запасается в виде нетранслируемой материнской мРНК. Только после оплодотворения новосинтезированная малая субъединица может объединяться с предобразованной большой субъединицей, чтобы сформировать функциональный фермент (Standart et al., 1986). С помощью методов рекомбинантных ДНК удалось выделить запасенную мРНК для актина и других белков.

Небезынтересно, что некоторые запасенные мРНК распределены по ооциту неравномерно. Такое неравномерное распределение РНК-последовательностей мы наблюдаем в цитоплазме ооцитов улитки и оболочника, но такая же локализация наблюдается в ооцитах морского ежа и лягушки (Rodgers, Gross, 1978). И если, по данным некоторых авторов (Rebagliati et al., 1985), в цитоплазме неоплодотворенных ооцитов Xenopus большая часть материнских мРНК распределена равномерно, то некоторые мРНК локализованы либо в анимальной, либо в вегетативной области ооцита. Из этих ооцитов была экстрагирована РНК, содержащая (поли)А, и затем для перевода молекул РНК в популяцию двухцепочечных ДНК была использована обратная транскриптаза. Эти двухцепочечные ДНК были встроены в векторы для клонирования и выращены по отдельности в клетках Ε. coli. Таким путем получили около двух миллионов клонов.