Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ_____________________ 211

Рис. 14.16. Демонстрация мРНК. локализованной в анимальном и вегетативном полюсах ооцита Xenopus. РНК получали из целого яйца (Я), областей анимального (А) и вегетативного (В) полюсов и фракционировали методом электрофореза в геле. РНК переносили с помощью Нозерн-блоттинга на бумажный фильтр, который инкубировали с радиоактивной ДНК клонов, полученных из кДНК. комплементарной мРНК ооцита. Радиоактивная ДНК клона Ан2 гибридизуется с мРНК, содержащейся в клетках анимального полюса и не содержащейся в клетках вегетативною полюса. Обратное распределение наблюдается для мРНК, которая гибридизуется с ДНК клона Вг1. (Вг1-РНК является той самой мРНК, которая упоминалась в гл. 8 как мРНК, кодирующая продукт, подобный фактору роста, играющему, по-видимому, важную роль в детерминации мезодермы.) (Из Reblagliati et al., 1986; фотография с любезного разрешения D. Melton.)

ДНК из этих клонов (ооцитной библиотеки Xenopus) была перенесена на два листа фильтровальной бумаги и денатурирована в условиях, обеспечивающих ее разделение на отдельные нити. Кроме того, исследователи отрезали от ооцита анимальные и вегетативные области и экстрагировали из этих частей содержащую (поли)А РНК. На этих РНК были синтезированы радиоактивные кДНК. Затем одну группу ДНК-содержащих фильтров инкубировали с кДНК для анимальных мРНК, а другую группу - с кДНК для вегетативных мРНК При измерении связывания радиоактивных кДНК оказалось, что большинство клонов связывали одинаковые количества кДНК из анимальной и вегетативной областей, свидетельствуя о равномерном распределении соответствующих мРНК. Однако около 1,2% клонов связывали только кДНК, полученную на мРНК анимальной области, а около 0,2% клонов связывали только кДНК, полученную на мРНК вегетативной области.

ДНК клонов, специфичных для анимальных или вегетативных мРНК, могли быть затем использованы для идентификации мРНК, локализованных в ооците неравномерно. Для этого РНК экстрагировали из целых яйцеклеток или из их анимальных или вегетативных областей и разгоняли в геле. Электрофоретически разделенные РНК переносили с помощью блоттинга (Нозерн-блоттинг) на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с радиоактивными ДНК-зондами для каждого из клонов, специфичных для определенной области ооцита.

Два из полученных результатов показаны на рис. 14.16. Таким образом, неравномерная локализация в цитоплазме предобразованных ооцитных мРНК может наблюдаться и в мозаичных, и в регуляционных яйцах.

Механизм трансляционного контроля ооцитных мРнк

В настоящее время предложено по крайней мере пять гипотез относительно регуляции трансляции ооцитных мРНК. Три из них касаются доступности молекул мРНК, тогда как две другие – эффективности трансляции мРНК. Эти гипотезы могут рассматриваться как конкурирующие друг с другом, однако вполне вероятно, что у большинства видов регуляция трансляции ооцитных мРНК осуществляется с помощью нескольких механизмов.

МАСКИРОВАННЫЕ мРНК. Согласно этой гипотезе, ооцитные мРНК физически замаскированы белками, поэтому мРНК не могут присоединиться к рибосоме. мРНК никогда не обнаруживается свободной от белков. Однако с мРНК могут быть ассоциированы белки различного типа. В 1966 г. Спирин предположил, что мРНК ооцита запасена в информосомах, рибонуклеопротеидных комплексах, где мРНК закрыта белками (Spirin, 1966). Эти замаскированные мРНК не способны связываться с рибосомами и поэтому не транслируются. При оплодотворении белки, экранирующие мРНК, отделяются (возможно, из-за изменений ионных условий, происходящих в ходе оплодотворения) и мРНК высвобождается, чтобы инициировать трансляцию.

Вскоре эта гипотеза была подтверждена. В 1968 г. в ооцитах морского ежа были обнаружены рибонуклеопротеидные (РНП) частицы, которые седиментировали медленнее, чем рибосомы (Infante, Nemer, 1968), а несколько позже было обнаружено, что эти частицы содержат разнообразные мРНК (Gross et al., 1973).

Серия экспериментов в лаборатории Рэффа показала, что ооцитная мРНК действительно запасается в такой форме, которая не способна к трансляции и чувствительна к ионным изменениям, происходящим при оплодотворении. Нерибосомные РНП-частицы выделили из зрелых ооцитов морского ежа и выяснили, что они содержат РНК с поли(А)-хвостами (Jenkins et al., 1978). Таким образом, эти РНП-частицы, по-видимому, содержат мРНК. РНП-частицы выделяли в растворах с двумя различными ионными силами (рис. 14.17). Одни частицы были выделены в «ооцитном» буфере, содержащем 0,35 мМ К⁺ и 5 мМ Mg²⁺, т.е. при ионных условиях, соответствующих неоплодотво-