Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 89

Рис. 10.9. Аппарат для Саузерн-блоттинга. Буфер для переноса проходит через гель, нитроцеллюлозу и бумажные полотенца благодаря капиллярному эффекту, захватывая с собой ДНК. Одноцепочечная ДНК задерживается нитроцеллюлозным фильтром. Положение ДНК на фильтре отражает положение фрагментов ДНК в геле.

ДНК инкубировали с радиоактивной кДНК к соответствующему гену (можно использовать также и мРНК). Радиоавтограф нитроцеллюлозного фильтра показал, где радиоактивная ДНК нашла себе комплементарную ДНК. В итоге Лaнг с коллегами показали (рис. 10.10), что помимо двух обычных генов мыши, продуцирующих КСФ-г,м и расположенных в рестрикционном фрагменте длиной 7800 пар оснований, злокачественные клетки имеют ген КСФ-г,м, полученный от вируса (о чем свидетельствует наличие последовательностей вирусной ДНК) и лежащий в рестрикционном фрагменте длиной 5500 пар оснований. Для каждого из клонов злокачественных клеток был получен аналогичный результат.

Экспрессию этих генов можно продемонстрировать с помощью РНК-блота (обычно называемого Нозерн-блотом). В отличие от Саузерн-блота, при котором из геля на бумагу переносят ДНК, при Нозерн-блоте (название не связано с фамилией исследователя) аналогичным образом из геля на бумагу переносят РНК. Нозерн-блоты весьма полезны при изучении накопления специфических мРНК в цитоплазме определенной клетки. В данном случае цитоплазматическую РНК изолируют из злокачественных клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г,м, и из незлокачественных клеток, инфицированных аналогичным ретровирусом, но лишенным гена КСФ-г,м. РНК из каждого клеточного клона фракционировали в геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр. После инкубации фильтра с кДНК к гену КСФ-г,м было обнаружено, что во всех злокачественных клонах транскрибируется ген КСФ-г,м. Другие клетки его не транскрибируют (рис. 10.11). Ланг с соавторами пришли к выводу, что в клетках транскрибируется искусственно выделенный ген КСФ-г,м, находящийся под контролем вируса. Далее оказалось, что эти клетки, которым требуется КСФ-г,м для роста, приобрели способность синтезировать свой собст-

•

Рис. 10.10. Интеграция ретровируса, содержащего ген КСФ-г,м, в геном клетки мыши. Представлены результаты гибридизации по Саузерну (блот) геномов из 20 клонов. ДНК была выделена из каждого клона, обработана рестриктазой Sac 1, разделена в геле, подвергнута блоттингу и гибридизована с радиоактивной кДНК к гену КСФ-г,м. Дорожки 2–19 содержат ДНК из злокачественных клеток, инфицированных ретровирусом, содержащим ген КСФ-г,м. Дорожка 1 содержит ДНК из незлокачественного клона, инфицированного аналогичным вирусом без гена КСФ-г,м; дорожка 20 содержит ДНК из неинфицированных зародышей мыши. Верхние зоны представляют ген КСФ-г,м из нормального генома мыши. Нижние зоны представляют ген КСФ-г,м, введенный вирусом. (Из Lang et al., 1985; фотография с любезного разрешения R. A. Lang.)