Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ_______________________________________ 121

Рис. 11.15. Амплификация генов хориона в фолликулярных клетках Drosophila (электронная микрофотография). Стрелками указаны места репликации ДНК. (Из Osheim, Miller, 1983; фотография с любезного разрешения О. L. Miller, Jr.)

Рис. 11.16. Локализация экдистерона на политенных хромосомах Drosophila. После присоединения экдистерона к хромосомам in situ он может быть выявлен с помощью флуоресцирующих антител. А. Фрагмент хромосом слюнных желез (микрофотография методом фазового контраста). Б. Тот же фрагмент в ультрафиолетовом свете. Видна иммунофлуоресценция в областях, чувствительных к экдистерону. (С любезного разрешения О. Pongs.)

Хромосомные пуфы и хромосомы типа ламповых щеток

Природа политенных хромосом и их пуфов была рассмотрена в гл. 10. Представленные в ней данные иллюстрируют контроль за активностью определенных генов на уровне транскрипции. Если к слюнным железам добавляют экдистерон, то наблюдается возникновение одних пуфов и исчезновение других. Образование пуфов опосредовано присоединением экдистерона к специфическим участкам на хромосомах. Это может быть продемонстрировано путем «сшивания» экдистерона с хроматином, которое фиксирует его положение на местах связывания. Затем добавляют кроличьи антитела против экдистерона и несвязавшиеся антитела удаляют промывкой. В конце добавляют меченные флуоресцеином козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика, и несвязывавшиеся антитела отмывают. В результате флуоресцентная метка должна обнаруживаться в тех местах, где козьи антитела связались кроличьими антителами, а кроличьи антитела должны присоединяться только к экдистерону. Таким образом, флуоресцентная метка должна появиться на хромосоме в каждом сайте, где был связан экдистерон (Gronemeyer, Pongs, 1980). Результаты свидетельствуют о том (рис. 11.16), что практически все экдистерон-чувствительные пуфы связывают экдистерон.

Экдистерон-чувствительные пуфы, обнаруживаемые у поздней личинки третьего возраста (когда она готовится стать куколкой), можно грубо разделить на три категории. Пуфы, которые исчезают в присутствии экдистерона; пуфы, которые быстро индуцируются экдистероном, и пуфы, которые появляются через несколько часов после стимуляции экдистероном. Ранние пуфы формируются в пределах 1 ч после добавления экдистерона. Кроме

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

122____________ ГЛАВА 11_______________________________________________________

того, они, по-видимому, синтезируют продукты, которые необходимы для индукции поздних пуфов. Если к культивируемым клеткам дрозофилы добавить ингибиторы синтеза белка вскоре после того, как образовались ранние пуфы, то экдистерон не будет стимулировать формирование поздних пуфов. Очевидно, таким образом, что для образования поздних пуфов требуются и экдистерон, и продукты ранних пуфов (Ashburner, 1974).

Важно отметить, что экдистерон не только стимулирует образование пуфов в определенных участках хромосом личинки, но вызывает также регрессию некоторых уже существующих пуфов. Один из таких пуфов находится в положении 68С на левом плече хромосомы III. Этот сайт содержит ген для Sgs 3, «белка клея», обеспечивающего прикрепление оболочки куколки к твердой поверхности (Korge, 1975). У личинок последнего возраста этот участок хромосомы образует пуф только в слюнных железах. Добавление экдистерона к культивируемым слюнным железам вызывает быструю регрессию этого пуфа и прекращение транскрипции с данного гена (Crowley, Meyerowitz, 1984). Таким образом. белок клея может синтезироваться, когда он нужен для прикрепления личинки к субстрату, но после этого ген выключается и происходит метаморфоз.

Как будет рассмотрено более подробно в следующей главе, транскрипционная активность связана с изменениями в хроматине, и эти изменения могут быть вызваны присоединением негистоновых белков хроматина. Переваривание хроматина дрозофилы ДНКазой I приводит к высвобождению белка с молекулярной массой 63000, который связывается со всеми экдизон-чувствительными локусами личинки третьего возраста (рис. 11.17). Хотя этот белок по своим размерам больше, чем белки, предположительно отвечающие за активацию транскрипции генов у позвоночных, он может выполнять аналогичную функцию в установлении и поддержании структуры хроматина, необходимой для активности генов (Mayfield et al., 1978).

Пуфы представляют собой расплетенную ДНК в определенных областях хромосом личинок насекомых. Так как эти хромосомы политенные, характерный вид пуфа создается тысячами нитей. Аналогичное расплетание ДНК в случае неполитенных хромосом наблюдается в ооцитах амфибий. Соответствующие структуры называют хромосомами типа ламповых щеток. На стадии диплотены мейоза компактные хромосомы амфибий образуют большие петли ДНК и втягивают их обратно после завершения этой стадии (рис. 11.18).

Представление о том, что подобное расплетание хромосом позволяет экспрессироваться определенным генам, может быть подтверждено с помощью гибридизации in situ. Для этого следует приготовить препараты хромосом ооцитов, денатурировать их и проинкубировать с радиоактивной РНК, которая кодирует определенный белок. После того как несвязавшаяся РНК удалена отмывкой, радиоавтография позволяет точно определить местоположение гена. На рис. 11.19 показана хромосома I на стадии диплотены из ооцита тритона Triturus cristatus после инкубации с радиоактивной мРНК для

Рис. 11.17. Локализация белка, высвобождающегося из хроматина Drosophila при гидролизе ДНКазой I, с помощью иммунофлуоресценции. После получения антител к этому белку и их связывания с политенными хромосомами антитела могут быть выявлены с помощью других, флуоресцирующих антител А. Микрофотография, полученная методом фазового контраста, Б. Тот же участок в ультрафиолетовом свете. Видны меченые сайты, чувствительные к экдистерону. (Рис. 11.16 и 11.17 можно сопоставить с рис. 10.26. на котором показана обычная последовательность пуфов.) (Из Mayfield et al., 1978; фотографии с любезного разрешения S. Elgin.)