Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 10.4. Метод секвенирования ДНК с использованием дидезоксинуклеотидов.

Рис. 10.5. Сравнение дезокси- и дидезоксинуклеотидов. А. Структуры нуклеотидов обоих типов. Б. З'-конец цепи, которая была терминирована включением дидезоксинуклеотида, поскольку он не содержит 3’-гидроксильную группу, необходимую для дальнейшей полимеризации ДНК.

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ 87

Рис 10.6. Пример секвенирования ДНК с помощью дидезокси-метода. (С любезного разрешения О. Guild.)

цепи различной дискретной длины, каждая из которых оканчивается остатком А.

Полученные радиоактивные фрагменты ДНК разделяют с помощью электрофореза Смеси фрагментов вносят в лунки на одной стороне геля и затем пропускают через гель электрический ток. Отрицательно заряженные фрагменты ДНК мигрируют в направлении положительного полюса, при этом меньшие по размеру фрагменты движутся быстрее, чем крупные. Фрагменты с наименьшим числом нуклеотидов движутся быстрее, чем фрагменты с большим числом нуклеотидов (рис. 10.4 и 10.6). Прочитывая наборы полос, определяют последовательность ДНК, комплементарную клонированному гену.

Перенос генов

Во многих случаях желательно получить ген, модифицировать его и затем вернуть в эукариотический организм. Это осуществляется с помощью трансфекции - метода, посредством которого фрагменты ДНК можно ввести в хромосомную ДНК клетки. Клонированную ДНК смешивают с селективным маркерным геном (таким, как ген тимидинкиназы вируса Herpes simplex) и высокополимерной ДНК из какого-либо другого организма. Эту смесь инкубируют с фосфатом кальция: при этом образуются ДНК-содержащие кристаллы, которые фагоцитируются клетками в культуре.

В случае дефицитных по тимидинкиназе клеток можно вырастить культуру в условиях, обеспечивающих выживание лишь тех клеток, которые захватили кристаллы ДНК–фосфат кальция (и потому экспрессируют ген тимидинкиназы) (Perucho et al., 1980; Robins et al., 1981). На рис. 10.7 показан опыт, в котором глобиновые гены человека смешивали с геном тимидинкиназы вируса Herpes и большими фрагментами ДНК хомячка. Селекция колоний на

1

Рис. 10.7. Трансфекция ДНК глобинового гена из генома одного вида в геном другого вида. Клонированные глобиновые гены человека, маркерный ген (ген тимидинкиназы), позволяющий проводить селекцию, и протяженные фрагменты ДНК из генома другого вида соосаждаются в виде кристаллов в фосфате кальция. Кристаллы, содержащие ДНК, захватываются клетками, и при соответствующих внутриклеточных условиях ДНК интегрируется в хромосомы клеток-хозяев. (По Watson et al., 1983.)