Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Гилберт С. Биология развития. Т.2.doc ,БИР.doc
Скачиваний:
516
Добавлен:
23.02.2015
Размер:
19.98 Mб
Скачать

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ__________________ 105

Рис. 10.33. Клонирование с вычитанием генов Xenopus laevis, репрессирующихся специфично на стадии гаструлы. К мРНК, выделенной на стадии гаструлы, была получена кДНК. которая затем была гибридизована с мРНК ооцита. Те фракции, для которых последовательности кДНК гаструлы не нашли комплементарные последовательности в мРНК ооцита, представляют собой продукты генов, активных на стадии гаструлы, но не в ооците. Эти гены были клонированы с помощью приготовления двухцепочечных кДНК и добавления линкеров, необходимых для встраивания в клонирующие векторы.

должна найти на фильтре свой комплемент среди мРНК данной стадии. Затем несвязавшуюся кДНК отмывали, а связавшуюся радиоактивную кДНК регистрировали с помощью радиоавтографии. Этот метод называют дот-блоттингом. На рис. 10.34 показаны временные зависимости экспрессии для 17 генов, которые функционируют на разных этапах гаструляции. Ни один из них не экспрессируется ранее средней бластулы на седьмом часу развития. Некоторые гены (DG64, DG39) экспрессируются сразу после этого, тогда как другие гены (например, DG72 или DG81) начинают транскрибироваться на стадии средней гаструлы примерно семью часами позже. После активации уровень активности некоторых генов (DG76, DG81) сохраняется, тогда как у других (DG56 или DG21) он существенно изменяется.

Если с помощью дот-блоттинга можно выявить временную специфичность экспрессии генов, то пространственную специфичность, т.е. тканеспецифический характер экспрессии генов, можно продемонстрировать с помощью модифицированного метода

Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.

106_______________ ГЛАВА 10_____________________________________________________________________________

Рис. 10.34. «Дот-блот»-гибридизация, демонстрирующая периоды транскрипционной активности 17 генов в развитии Xenopus. Накопление специфичных мРНК в цитоплазме определяли с помощью запекания всей мРНК с последовательных стадий эмбриогенеза и инкубации приготовленной бумажной полоски с радиоактивной ДНК, полученной из кДНК-клона, специфичного для гаструлы. При совмещении этих полосок получается картина динамики активности специфичных генов в развитии. (Из Jamrich et al., 1985; фотография с любезного разрешения I. Dawid, M. Sargent.)

Рис. 10.35. Визуализация мРНК, специфичной для эктодермы, у морского ежа S. purpuratus с помощью гибридизации in situ. На верхних фотографиях представлены срезы личинок на стадии средней гаструлы (А) и плутеуса (Б) при фазово-контрастной микроскопии. В нижнем ряду показаны те же срезы, гибридизованные с радиоактивной кДНК к мРНК, специфичной для эктодермы, при негативном контрасте. Гибридизация с РНК (выявляется как белые точки) происходит только в тех клетках, которые вошли или войдут в состав дорсальной эктодермы. (Из Lynn et al., 1983; фотографии с любезного разрешения R. Angerer, L. Angerer.)