- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Экспансия днк
Под экспансией ДНК понимают увеличение числа копий коротких повторяющихся последовательностей нуклеотидов внутри кластера при передаче генетической информации от родителей потомкам. В настоящее время различают два класса этих генетических явлений. При экспансии ДНК первого класса происходит резкое и стабильное увеличение числа копий определенных повторов (10) на фоне полного отсутствия обратного сокращения длин их кластеров. При экспансии ДНК второго класса изменения затрагивают меньшее число повторов (4), а образование мутационных вставок и обратных делеций повторяющихся последовательностей происходит с одинаковой скоростью. Мутации первого класса ассоциируются с болезнью Хантингтона, синдромом ломкости X-хромосомы, болезнью Кеннеди, миотонической дистрофией, спиноцеребральной атаксией типа I и рядом других неврологических заболеваний. У здоровых индивидуумов имеет место полиморфизм по числу копий повторяющихся единиц в этих локусах, и экспансия повторов приводит к развитию таких заболеваний после того, как количество копий повторяющихся единиц (как правило, тринуклеотидов) начинает превышать определенное значение. В результате изменяется уровень экспрессии гена, содержащего повторы, или же свойства кодируемого геном белка. Экспансия динуклеотидов CA или AT, относящаяся ко второму классу мутаций, ассоциируется чаще всего с наследственным раком кишечника.
В наследовании предрасположенности к экспансии ДНК имеет место импринтинг (см. раздел 3.2.5). Процесс экспансии происходит во время митотической репликации ДНК на ранних стадиях эмбриогенеза. Для развития синдрома ломкости X-хромосомы только в материнской X-хромосоме должен образовываться премутационный аллель, содержащий 50–200 копий тринуклеотида CGG. При наличии такой премутации в эмбриональном развитии мужской особи формируется мутантный аллель, содержащий 200–2000 копий этого повтора. Подобной экспансии ДНК никогда не происходит, если премутация локализована на отцовской X-хромосоме. Приведенный пример с синдромом ломкости X-хромосомы указывает на необходимое условие для экспансии ДНК и во всех остальных случаях: увеличение числа копий повторов у родителей до определенного порогового значения. Как только формируется премутантный аллель в геноме родителей, у следующего поколения происходит образование истинно мутантного аллеля, сопровождаемое развитием соответствующего патологического состояния организма.
Рис. I.55. Модели механизма экспансии ДНК во время репликации
а– с проскальзыванием ДНК-полимеразы;б– с участием отстающей цепи ДНК;в– с привлечением механизма конверсии генов
Среди возможных ди- и тринуклеотидных последовательностей лишь для CAG/CTG, CGG/CCG и AT продемонстрирована экспансия in vivo, приводящая к патологиям. Предполагают, что возможность экспансии именно этих, а не других повторов определяется их способностью образовывать стабильные шпильки. Предложены три модели, объясняющие механизм экспансии ДНК, в которых участвуют шпильки, образованные соответствующими повторами (рис. I.55). Первая модель предполагает проскальзывание реплицирующей молекулы ДНК-полимеразы на повторе в обратном направлении, сопровождаемое образованием шпильки в строящейся цепи ДНК (см. рис. I.55,а). В этом случае в следующем раунде репликации или по завершении репаративного синтеза ДНК длина кластера повторяющихся последовательностей увеличится на размер сегмента ДНК, образовавшего шпильку. Согласно второй модели при репликации отстающей цепи ДНК на соответствующем повторе матричная ДНК некоторое время находится в одноцепочечной форме (см. рис. I.55,б). В это время одноцепочечная последовательность отстающей цепи, содержащая повтор, может образовать шпильку, которая блокирует синтез ДНК в данном месте. Предполагается, что белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК (SSB-белок), не может эффективно взаимодействовать с двухцепочечной шпилькой, однако сохраняет способность связываться с одноцепочечной петлей на вершине шпильки, обеспечивая инициацию репликации ДНК с этого места. После того как ДНК-полимераза прореплицирует одну половину шпильки, ее структура разрушится, что приведет к снятию блока репликации перед шпилькой и ее нормальному продолжению. Однако синтезированный перед этим фрагмент ДНК, соответствующий одной половине шпильки, оказывается лигированным с уже имевшимся фрагментом Оказаки. Он не может отделиться от матрицы, которая своими нуклеотидами, расположенными по концам, образует водородные связи с повторами матрицы. Далее избыточная последовательность включается в растущую цепь ДНК и после ошибочной репаративной коррекции шпильки приводит к увеличению размера этого кластера повторяющихся последовательностей, т.е. их экспансии. В соответствии с третьей моделью шпильки, образующиеся в местах соответствующих кластеров повторяющихся последовательностей на разных молекулах ДНК, могут взаимодействовать друг с другом, что будет сопровождаться возникновением сложно структурированной матрицы для репликации. В процессе синтеза ДНК на такой сложной матрице весьма вероятно включение избыточной последовательности в виде повтора во вновь синтезируемую ДНК (см. рис. I.55,в). Аналогичный эффект может быть достигнут и в результате сложной последовательности событий рекомбинации с участием этих шпилек.
Заканчивая обсуждение недавно обнаруженных "необычных" мутационных изменений геномной ДНК, связанных с увеличением числа копий (экспансией) коротких повторяющихся последовательностей, следует подчеркнуть, что они не изменяют традиционных представлений о мутагенезе. Хотя такие мутации ассоциированы с конкретными генетическими локусами, содержащими повторы определенной структуры, процесс экспансии этих последовательностей носит случайный характер и, возможно, запускается первичным мутационным изменением в кластере повторов, которое делает более вероятным формирование шпилечной или иной пространственной структуры подобных кластеров. Однако не так давно была описана еще одна группа мутаций, само существование которых идет в разрез с общепринятым неодарвиновским представлением о механизмах возникновения мутаций. В следующем разделе речь пойдет об адаптивных мутациях; их возникновение в геноме носит не случайный, а направленный характер.