2. Редактирование пре-мРнк

Недавно появились сообщения о новых механизмах изменения кодирующего потенциала мРНК на посттранскрипционном уровне, названных редактированием РНК (editing). Оказалось, что в клетках многих организмов имеются ферментные системы, способные с высокой специфичностью изменять первичную структуру мРНК, что, в свою очередь, меняет их кодирующий потенциал и приводит к образованию новых функционально значимых белков. Одним из первых был описан механизм редактирования РНК для митохондрий внутриклеточных паразитов – жгутиковых трипаносомид: Crithidia fasciculata, Leishmania tarentolae и Tripanosoma brucei. Митохондриальная (мт) ДНК этих одноклеточных представлена 20–50 идентичными копиями катенанов кольцевых молекул (зацепленные друг за друга кольца в виде гирлянды), называемых максикольцами, которые являются функциональными аналогами мтДНК других эукариот. Кроме того, их митохондрии содержат несколько тысяч копий небольших молекул ДНК (миникольца), функциональное значение которых до недавнего времени оставалось неизвестным. В результате функционирования механизма редактирования мРНК в специфические участки митохондриальной мРНК встраиваются многочисленные остатки уридина (U), не кодируемые максикольцами митохондриального генома, тогда как другие остатки U, включенные в мРНК в результате транскрипции мтДНК, удаляются из транскриптов. При таком "редактировании" кодирующего потенциала мРНК могут быть изменены до нескольких сотен остатков U (табл. I.7), что приводит к образованию протяженных открытых рамок считывания (ОРС), кодирующих у жгутиковых высокогомологичные белки, а также новых кодонов инициации трансляции (AUG), которые отсутствуют у мРНК, не подвергнутых редактированию. Такие модификации мРНК могут создавать новые терминирующие кодоны (UAG и UAA), а также затрагивать 3’-концевые нетранслируемые последовательности мРНК и poly(A)-хвосты. Функциональное значение редактирования этих нетранслируемых последовательностей мРНК неизвестно. Они, как полагают, могут оказывать влияние на стабильность соответствующих мРНК и их содержание внутри клеток.

Выбор последовательностей нуклеотидов в мРНК, которые подвергаются редактированию у трипаносомид, по-видимому, осуществляется с участием небольших РНК-проводников (guide RNAs, gRNA), частично комплементарных редактируемым участкам мРНК и кодируемых миникольцами мтДНК. gРНК являются первичными транскриптами, так как содержат на 5’-концах нуклеозиддифосфаты или нуклеозидтрифосфаты. На их 3’-концах обнаруживают 15 некодируемых остатков U, которые добавляются посттранскрипционно 3’-концевой уридилилтрансферазой.

Таблица I.7

Различные способы редактирования мРнк

Объект	Модифицированные или добавленные нуклеотиды
Митохондрии трипаносом	AAUUUAUGUUGUCUUU
Митохондрии P. polycephalum	AUCUCUAAGGGUUUAACCGG   Сдвиг рамки Сдвиг рамки
Парамиксовирусы (ген Р)	AUUAAAAAGGGGCACAC  Сдвиг рамки
Митохондрии позвоночных	CAGUAAAAAAAAAAAAAA  СТОП-кодон
высших растений	UUUUUCAUUGUGGUUUAC   Phe Tyr
Хлоропласты высших растений	AAUAAUAUGGCGAAACAU  Инициирующий кодон
Ионные каналы млекопитающих, регулируемые глутаматом	UUUAUGCGGCAAGGA  Arg
Ген аполипопротеина В млекопитающих	GAUAUAAUUUGAUCAGUAUA  СТОП-кодон

Шесть или более 5’-концевых нуклеотидов gРНК комплементарны последовательности редактируемой мРНК, непосредственно предшествующей блоку нуклеотидов, подвергаемых редактированию. Уже сейчас ясно, что gРНК не служат матрицей для встраивания модифицируемых нуклеотидов в процессе посттранскрипционного редактирования РНК. Обсуждается гипотетический механизм этого процесса, который, к сожалению, не объясняет полностью имеющиеся факты. В соответствии с гипотезой образующиеся ошибочно спаренные (некомплементарные) нуклеотиды в гибридах gРНК и редактируемой мРНК служат сигналами для расщепления мРНК с последующим добавлением по местам разрывов остатков U. При этом места комплементарного спаривания нуклеотидов в РНК–РНК-гибридах защищены от редактирования. Кроме того, предполагают, что редактирование мРНК происходит с участием сложных нуклеопротеидных комплексов – эдитосом, по аналогии со сплайсингом, где участие аналогичных комплексов – сплайсом в настоящее время доказано.

Другой тип редактирования РНК характерен для митохондрий слизневиков P. polycephalum (см. табл. I.7). В этом случае отдельные остатки С встраиваются во множественные участки митохондриальных мРНК, что приводит к сдвигам рамок считывания. Механизм данного процесса неизвестен.

Своеобразно решают задачу изменения кодирующего потенциала своих мРНК парамиксовирусы, в частности вирусы кори и свинки. Во время транскрипции гена P, кодирующего белок, ассоциированный с полимеразой, РНК-полимераза совершает ошибки, что сопровождается вставками лишних остатков гуанозина (G) в мРНК и, как следствие, сдвигом рамок считывания при их трансляции.

В транскриптах митохондрий позвоночных животных в процессе полиаденилирования мРНК происходит создание бессмысленных кодонов UAA и UGA, приводящих к преждевременной терминации трансляции, что в конечном счете сопровождается появлением новых полипептидных цепей. Тот же самый механизм реализуется в ядрах позвоночных.

Другая группа механизмов редактирования мРНК основана на ферментативном взаимопревращении остатков нуклеотидов. Например, в большинстве митохондрий высших растений в результате дезаминирования происходит превращение остатков С в U. В меньшей степени для них характерен обратный процесс: UC. При этом изменяется смысл кодонов в мРНК и, как следствие, происходит замена соответствующих аминокислот в белках. В настоящее время еще не охарактеризованы ферментные системы, осуществляющие такие посттранкрипционные превращения нуклеотидов на уровне мРНК.

Отдельно следует упомянуть редактирование мРНК, происходящее в хлоропластах высших растений, в частности у кукурузы и табака. Оказалось, что предсказание последовательностей аминокислот в белках хлоропластов, сделанное на основании последовательностей нуклеотидов их генов, часто не соответствует действительности. Так, в гене rpl2 хлоропластов кукурузы и гене psbL хлоропластов табака находится кодон AСG в том месте, где ожидается расположение наиболее распространенного кодона инициации трансляции ATG. При созревании транскриптов этих генов происходит их посттранскрипционная модификация, сопровождаемая превращением СU.

Своеобразный механизм посттранскрипционного редактирования РНК описан для транскриптов генов, кодирующих ионные каналы мозга млекопитающих, которые участвуют в передаче сигналов в синапсах центральной нервной системы. Известно, что субъединицы двух близкородственных классов глутаматных рецепторов содержат в определенных сегментах своих полипептидных цепей, формирующих каналы, остатки глутамина или аргинина, что оказывает существенное влияние на функционирование этих каналов. Оказалось, что субъединицы обоих классов кодируются генами, у которых в соответствующем месте имеется только кодон для глутамина (СAG), хотя в кДНК, полученной с использованием мРНК указанных субъединиц в качестве матрицы, в этом месте обнаружен также и аргининовый кодон СGG.

Интересно, что мРНК одной из субъединиц рецептора, принадлежащей на основании аминокислотных последовательностей к одному определенному классу (называемому здесь класс 1), подвергаются редактированию на 100%, тогда как транскрипты трех других субъединиц того же класса вообще не изменяются, несмотря на 90–95%-ную гомологию 30-звенных последовательностей, окружающих редактируемый сайт. Транскрипты двух субъединиц, принадлежащих к другому классу, редактируются с эффективностью соответственно 40 и 80%. Таким образом, во всех этих случаях имеет место количественная регуляция эффективности редактирования мРНК рецепторов мозга, что необходимо для пропорционального внутриклеточного синтеза соответствующих субъединиц. Механизм такой своеобразной регуляции экспрессии генов в настоящее время, к сожалению, не известен. Предполагают, что эдитосомы могут узнавать характерные элементы вторичной структуры мРНК, по-разному подвергающиеся редактированию.

Широкая, может быть, даже более широкая, чем мы сейчас представляем себе, распространенность посттранскрипционного редактирования мРНК у живых организмов указывает на этот механизм как на один из обычных способов реализации генетической информации. Использование таких модификаций пре-мРНК функционирующими генетическими системами при экспрессии генов расширяет кодирующий потенциал генома и добавляет еще одну возможность регуляции их функционирования на посттранскрипционном уровне. В табл. I.8 суммированы данные об использовании редактирования мРНК у животных и некоторых их вирусов, которые наглядно демонстрируют распространенность этого явления у данной группы организмов.

В заключение рассмотрим еще один наиболее хорошо изученный пример редактирования мРНК аполипопротеина B (ApoB) млекопитающих, участвующего в транспорте холестерина и триглицеридов в крови. Уже давно у млекопитающих обнаружили две формы ApoB, кодируемые одним и тем же геном и образующиеся в результате редактирования ApoB-мРНК (рис. I.11,а). Уникальный ген АpoB человека содержит 29 экзонов, и его общая длина составляет 43 т.п.о. Длина мРНК этого гена, кодирующей ApoB100 с молекулярной массой 512 кДа, составляет 14 тысяч оснований (т.о.). В середине самого большого экзона 26 имеется глутаминовый кодон СAA, который в результате редактирования мРНК превращается в терминирующий кодон UAA. Некоторые из мРНК, подвергшихся редактированию, расщепляются по криптическому (не функционирующему до расщепления) сайту полиаденилирования, что приводит к образованию более короткой

Таблица I.8