3. Методы скрининга клонотек генов

Все методы получения из клонотек генов требуемых последовательностей нуклеотидов можно разделить на две группы. При использовании первой группы методов рекомбинантные бактерии или фаговые частицы исследуют на наличие в них искомых последовательностей нуклеотидов. Во втором случае присутствие этих последовательностей обнаруживают косвенно, по появлению в бактериальных клетках или фаговых лизатах продуктов экспрессии искомых генов – РНК, белков или ферментативной активности.

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рассевают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках.

После отмывки фильтров от несвязавшегося радиоактивного зонда их высушивают и прикладывают к рентгеновской пленке. Образование специфических гибридов обнаруживают после проявления рентгеновской пленки по появлению на ней четких гибридизационных сигналов в виде темных пятен, положение которых точно соответствует таковому определенных колоний или бляшек на исходной чашке Петри. В результате проведения такого исследования точно идентифицируются бактериальные колонии или фаговые бляшки, содержащие искомые рекомбинантные ДНК. С этого момента с помощью обычных микробиологических и биохимических методов можно получать неограниченное количество идентичных копий клонированной последовательности нуклеотидов ДНК для дальнейших исследований. В ряде случаев, когда нет необходимости в скрининге большого числа клонов, гибридизацию с зондами можно заменить ПЦР. При таком подходе в качестве источника матричной ДНК используют суспензию бактериальных клеток или фаговых частиц отдельных клонов без специальной очистки матричных нуклеиновых кислот.

Часто бывает, что первичная структура искомого гена неизвестна. Тогда применяют один из следующих способов. Во-первых, можно очистить небольшое количество белка, кодируемого клонируемым геном, и определить последовательность его нескольких N-концевых аминокислот. На основании этих данных с учетом вырожденности генетического кода и частоты встречаемости аминокислотных остатков у исследуемого организма синтезируют олигонуклеотидные зонды, которые также используют для гибридизации in situ, аналогично тому как было описано выше. Во-вторых, клонотеку генов или кДНК получают с использованием экспрессирующих векторов. В этом случае если 5'-концевая часть клонируемого гена будет находиться близко от промотора вектора или его кодирующая часть будет соединена в одной рамке считывания с инициирующим ATG-кодоном, то в бактериальных клетках или фаговых лизатах можно обнаружить появление специфического белкового продукта или ферментативной активности. Если рекомбинантный белок неактивен и представляет собой лишь часть полипептидной цепи нативного фермента, его обнаруживают иммунохимическими методами. В ряде случаев отбор нужных клонов может проводиться с помощью генетических методов с использованием специально сконструированных векторных плазмид.

Рассмотренные способы не исчерпывают всех методических подходов, используемых для идентификации определенных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов. Но и эти часто применяемые методы дают представление о том, каким путем сегодня можно выделить индивидуальный ген и добиться его экспрессии в новом генетическом окружении.