- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Белки животных, участвующие в ner
Белковая система |
Белки системы |
Ферментативная активность |
Функция в репарации |
XPA |
XPA (p31) |
Связывание ДНК |
Распознавание повреждения |
RPA |
p70 p34 p11 |
То же |
То же |
TFIIH |
XPB/ERCC3 (p89) XPD/ERCC2 (p80)
р62 р44
Cdk7 (p41) CycH (p38) p34 |
ДНК-зависимая АТРаза Локальное расплетание ДНК Фактор транскрипции Киназа, активирующая Cdk |
Образование преинцизионного комплекса
Сопряжение транс-крипции и репарации
|
XPC |
XPC (p125)/ HHR23B (p112) |
Связывание ДНК |
? |
XPF |
XPF/ERCC4 (p112) ERCC1 (p33) |
Эндонуклеаза |
5’-Концевое надреза-ние ДНК |
XPG |
XPG/ERCC5 (p135) |
» |
3’-Концевое надреза-ние ДНК |
белков в очищенном состоянии, могут не иметь прямого отношения к их функциям в системе NER.
XPA – белок с молекулярной массой 31 кДа, обладает доменом типа "цинковые пальцы", участвует в распознавании поврежденного участка ДНК. Он также взаимодействует с другими компонентами системы и может функционировать в качестве фактора нуклеации для экзонуклеазы. XPA взаимодействует своим N-концевым доменом с гетеродимером ERCC1–XPF, а С-концевым доменом – с TFIIH. Кроме того, белок RPA (HSSB) образует комплекс с XPA и усиливает его специфичность в отношении поврежденной ДНК.
RPA (HSSB) – тример, состоящий из белковых субъединиц р70, р34 и р11, необходим для репликации ДНК и репаративного синтеза, а также для прохождения этапа двойного надреза ДНК во время эксцизионной репарации. Он обладает умеренным сродством к поврежденной ДНК.
TFIIH – олигомерный комплекс, в состав которого входят белки р89, р80, р62, р44, р41, р38 и р34. Этот белковый комплекс первоначально был открыт как один из семи основных факторов транскрипции, необходимых для эффективного функционирования РНК-полимеразы II. Случайно было установлено, что его субъединица р89 идентична белку репаративного комплекса XPB, а также обнаружено отсутствие функциональной комплементации между бесклеточными экстрактами клеток с мутантными белками XPB и XPD, определяемой по восстановлению репарирующей активности в смешанных экстрактах. Все это привело к пониманию того, что весь комплекс TFIIH представляет собой фактор репаративной системы. Белки XPB и XPD являются ДНК-зависимыми АТРазами, обладают так называемыми хеликазными доменами и могут (как и сам фактор TFIIH) вызывать диссоциацию гибридов, образованных между короткими фрагментами ДНК и одноцепочечной ДНК.
XPC – белок с молекулярной массой 125 кДа, существует в виде гетеродимера в комплексе с белком р58, который является гомологом белка Rad23 дрожжей (HHR23B). XPC слабо связывается с TFIIH и очень прочно – с одноцепочечной ДНК.
ERCC1/XPF – чрезвычайно прочный белковый комплекс, с которым взаимодействует белок XPA. Он обладает эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК.
XPG – белковый комплекс, обладающий эндонуклеазной активностью, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК; вовлекается в эксцизионный комплекс посредством взаимодействия с TFIIH и RPA.
Механизм NER. Процесс NER условно можно разделить на четыре этапа: а) распознавание поврежденного участка ДНК; б) двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия); в) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; г) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК. Феномен NER, как и многие другие генетические явления, имеющие общебиологическое значение, впервые обнаружен у E. coli. Было установлено, что мутантные УФ-чувствительные клетки E. coli не могут удалять из ДНК тиминовые димеры, возникающие в ответ на действие УФ-света. Вскоре стало ясно, что система эксцизионной репарации не является специфичной в отношении только тиминовых димеров, но способна распознавать и удалять любые повреждения ДНК, возникающие в результате ковалентных модификаций составляющих ее мономеров. Для понимания механизмов узнавания системой эксцизионной репарации поврежденных участков ДНК необходимо ответить, по крайней мере, на три важных вопроса: 1) распознает ли система только поврежденные (модифицированные) основания в ДНК; 2) как система осуществляет выбор цепи ДНК для репарации; 3) каковы молекулярные механизмы распознавания поврежденных участков?
Оказалось, что поврежденные (модифицированные) основания – не единственный субстрат для этой ферментной системы. NER человека распознает и удаляет одиночные ошибочно спаренные нуклеотиды, а также петли длиной в 1–3 нуклеотида. Однако в отличие от истинной репаративной системы, удаляющей неправильно спаренные основания, NER не может идентифицировать, нуклеотид какой цепи ДНК оказывается правильным. В результате происходит вырезание неспаренных нуклеотидов из любой цепи случайным образом. В отличие от только что рассмотренной ситуации NER человека способна различать цепи ДНК в случае распознавания поврежденных нуклеотидов. В частности, показано, что при наличии в ДНК димеров тимина циклобутанового типа вырезание нуклеотидов происходит исключительно из поврежденной цепи. Механизм такого распознавания в настоящее время неизвестен. К сожалению, остается непонятным и молекулярный механизм узнавания самих поврежденных оснований. Следует заметить, что система способна распознавать повреждения как сильно, так и слабо деформирующие вторичную структуру ДНК. При этом не обнаружена линейная зависимость между коэффициентом специфичности нуклеазы (kcat/km) и уровнем деформации двойной спирали ДНК. Показано, что в процессе распознавания участвуют белковые комплексы XPA/RPA, которые преимущественно связываются с поврежденной ДНК, и TFIIH, обладающий АTP-зависимой ДНК-расплетающей активностью. Последний взаимодействует с поврежденным участком ДНК и по аналогии с соответствующим механизмом у E. coli локально раскручивает ДНК, создавая основной преинцизионный комплекс с поврежденной ДНК.
Недавно было установлено, что три фермента репарации, обладающие узкой субстратной специфичностью: ДНК-фотолиаза (удаление пиримидиновых димеров), урацилгликозилаза (удаление урацила из ДНК) и экзонуклеаза III (гидролиз ДНК в AP-сайтах), втягивают поврежденный участок из двойной спирали в полость фермента, что приводит кофактор или аминокислотные остатки активного центра этих ферментов в непосредственный контакт с расщепляемыми связями ДНК. Не исключено, что система эксцинуклеазы действует таким же образом.
Основные этапы функционирования NER, следующие за распознаванием поврежденного участка ДНК, представлены на рис. I.59. После того как комплекс XPA–RPA связывается с измененным участком ДНК, XPA взаимодействует с комплексом TFIIH, который создает преинцизионный комплекс, что сопряжено с гидролизом ATP. ATP-зависимое расплетание ДНК комплексом TFIIH подготавливает ее к взаимодействию с двумя XP-белками, обладающими нуклеазной активностью. XPG связывается с TFIIH и вносит одноцепочечный разрыв с 3’-конца повреждения. Аналогично комплекс ERCC1–XPF взаимодействует с XPA в составе преинцизионного комплекса и способствует одноцепочечному разрыву с 5’-конца повреждения. Образование обоих разрывов является ATP-зависимым, и их расположение на ДНК высокоспецифично. Как правило, происходят разрывы 5-й и 24-й фосфодиэфирных связей соответственно от 3’- и 5’-концов поврежденных участков. Однако расположение точек разрывов может варьировать (см. выше). Таким образом, в результате подобных одноцепочечных надрезов ДНК может освобождаться фрагмент длиной 24–32 нуклеотида с преобладанием фрагментов длиной 27–29 нуклеотидов. На расположение сайтов одноцепочечных разрывов оказывают влияние как характер повреждения, так и последовательности нуклеотидов (контекст), окружающих поврежденный участок. Ту же самую картину инцизии обнаруживают in vivo в ооцитах Xenopus и у Schizosaccharomyces pombe. На этом основании делают вывод об универсальном механизме эксцизионной репарации у эукариот.
Рис. I.59. Модель эксцизионной репарации (NER) у млекопитающих
Обозначены белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия, возникающие при функционировании NER. A–F – продукты генов XPA–XPF
Репаративный синтез ДНК у человека является PCNA-зависимым (см. раздел 4.1.3), т.е. может осуществляться с участием ДНК-полимераз Pol и Pol. PCNA связывается с системой праймер–матрица под действием фактора репликации RFC, откуда следует, что последний также участвует в репаративном синтезе ДНК. В опытах с бесклеточными системами моноклональные антитела к Pol специфически подавляют репаративный синтез. Однако оказалось, что в тех же высокоочищенных бесклеточных системах вместо Pol с аналогичным эффектом могут быть использованы Pol и даже фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Это означает, что реконструированные из очищенных компонентов бесклеточные системы лишь в ограниченной степени имитируют биохимические процессы, происходящие в живых клетках. В настоящее время считается, что обе ДНК-полимеразы – Pol и Pol участвуют в репаративном синтезе ДНК у человека.
Сопряжение NER с транскрипцией. Транскрибируемые последовательности нуклеотидов ДНК, особенно в матричной цепи, репарируются с большей скоростью, чем нетранскрибируемые последовательности. Интересно, что в клетках больных с синдромом Кокайна не наблюдается такой асимметрии в репарации.
В клетках E. coli белковый фактор, кодируемый геном mfd и сопрягающий транскрипцию и репарацию, замещает остановившиеся перед повреждением молекулы РНК-полимеразы, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса. При этом он одновременно привлекает экзонуклеазный репаративный комплекс к поврежденному участку ДНК. В клетках животных ген CSB кодирует белок с молекулярной массой 160 кДа, который содержит так называемый хеликазный домен (мотив) и, возможно, выполняет те же функции, что и белок Mfd у E. coli. На основе поведения клеток с мутантными генами белков CSA и CSB разработана простая модель механизма, с помощью которого обеспечивается асимметричная репарация цепей ДНК. В соответствии с этой моделью РНК-полимераза II, остановившаяся в процессе транскрипции перед поврежденным участком ДНК, распознается комплексом CSA–CSB и перемещается в сторону от повреждения без разрушения четвертичной структуры транскрипционного комплекса. Одновременно комплекс CSA–CSB привлекает компоненты репаративной системы XPA и TFIIH к месту повреждения ДНК и помогает сборке эксцинуклеазного комплекса. Нуклеотиды поврежденной цепи вырезаются, и брешь репарируется. После этого РНК-полимераза в составе транскрипционного комплекса продолжает транскрипцию.
Регуляция NER. Для клеток животных не характерен так называемый SOS-ответ, свойственный клеткам E. coli и представляющий собой суммарную реакцию бактериальной клетки на повреждение ДНК различными агентами, что проявляется, в частности, в усилении транскрипции генов NER. Точно так же посттрансляционные модификации белков репарации, происходящие в ответ на повреждение ДНК, не влияют на активность эксцинуклеазы человека. Было обнаружено, что повреждения ДНК стабилизируют белок р53 – белок-супрессор опухолевого роста, который является регулятором транскрипции. Имеются данные о том, что белок р53 может взаимодействовать с белками XPB и RPA, необходимыми для NER. Однако клетки с инактивированными генами р53 (p53(-/-)), как и клетки дикого типа, эффективно удаляют из поврежденной ДНК два основных фотопродукта, возникающих под действием УФ-света, и обладают такой же устойчивостью к УФ. Поэтому в настоящее время считается, что белок р53 не оказывает прямого влияния на NER. Белки Cdk7 и циклин H, которые образуют Cdk-активирующую киназу, входят в состав комплекса TFIIH, что позволяет предполагать наличие связи репарации ДНК с фазами клеточного цикла.