- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирования ДНК-полимераз не является абсолютной. Поскольку выбор очередного нуклеотида для включения в растущую цепь ДНК определяется в результате взаимодействия белков и ферментов системы репликации и матричной ДНК, изменение свойств этих белков или матрицы как спонтанно, так и под действием различных модифицирующих агентов может приводить к ошибкам в репликации ДНК и мутациям.
Ошибки репликации. Как уже обсуждалось в разделе 4.1, синтез ДНК происходит в результате последовательного ферментативного присоединения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, комплементарных матричной ДНК, к 3’-концевому нуклеотиду растущей цепи ДНК. Точность этого процесса определяется различиями в свободной энергии у канонических или ошибочных пар азотистых оснований ДНК, образующихся по правилам Уотсона–Крика в водных растворах. Различия составляют 1–3 ккал/моль и обеспечивают точность репликации в пределах не более одного ошибочно включенного нуклеотида на каждые 100 нуклеотидов.
Генетические методы определения частоты ошибок репликации, возникающих в процессе синтеза ДНК in vitro, бывают двух типов. При одном подходе измеряют частоту прямых мутаций, приводящих к инактивации какого-либо гена, изменение которого легко определить фенотипически. Удобной системой, основанной на таком принципе, является репликативная форма ДНК бактериофага M13mp2, содержащая часть гена -галактозидазы в виде одноцепочечной бреши, застраивающейся испытуемой ДНК-полимеразой в бесклеточной системе. Ошибки синтеза ДНК в этом случае выявляют по потере или уменьшению активности -галактозидазы, что не отражается на жизнеспособности бактериофага, который образуется после введения такой ДНК в бактериальные клетки с помощью трансфекции. С применением этого метода обнаруживают до 200 различных замен оснований, а также делеции, мутации со сдвигом рамок считывания и сложные генные перестройки.
При другом подходе к определению точности синтеза ДНК in vitro измеряют частоту обратных мутаций, восстанавливающих (под действием точковой мутации) последовательность нуклеотидов гена, активность белкового продукта которого была нарушена в результате, например амбер-мутации. Этот метод обладает большой чувствительностью, позволяя определять мутации, происходящие с частотами 10-6–10-8 на нуклеотид за одну генерацию. Однако он ограничен возможностью определения мутаций лишь одного конкретного типа.
Частота ошибок репликации увеличивается из-за спонтанных повреждений геномной ДНК, возникающих в результате ее депуринизации в физиологических условиях. Депуринизация является следствием разрыва N-гликозидной связи, соединяющей в молекуле ДНК пуриновые основания с остатками дезоксирибозы. По оценкам Линдаля и Ниберга депуринизация ДНК в организме происходит с частотой 310-11 на нуклеотид в секунду, что в 100 раз выше частоты спонтанной потери пиримидиновых оснований ДНК в тех же условиях. Простой расчет показывает, что при такой частоте этих событий в соматической клетке человека должно происходить ~105 депуринизаций/день. Репликативный комплекс на ДНК-матрице взаимодействует с апуринизированным сайтом и включает в синтезируемую цепь ДНК преимущественно остатки дезоксиаденозина.
Многие бактериальные и эукариотические ДНК-полимеразы, осуществляющие репликацию ДНК, обладают 3’5’-экзонуклеазной корректирующей активностью, и поэтому ошибочно включенные нуклеотиды, некомплементарные матрице, удаляются с 3’-конца растущей цепи ДНК перед включением следующего нуклеотида в строящуюся цепь ДНК. Наличие у ДНК-полимеразных комплексов такой активности существенно повышает точность функционирования систем репликации.
Мутагенные воздействия. Усилий систем репликации становится недостаточно в стрессовых ситуациях, когда организм подвергается массированному мутагенному воздействию. Однако даже присутствие незначительного количества мутагенов в окружающей среде вызывает непрерывное накопление мутаций в геноме соматических клеток, хотя и с небольшой скоростью. Процесс накопления мутаций, избежавших коррекции системами репарации, является кумулятивным – к ранее существовавшим мутациям неуклонно добавляются новые, и суммарное количество мутаций в геноме (генетический груз) возрастает. Процесс накопления мутаций – статистический, поэтому в настоящее время можно предсказывать лишь вероятность возникновения конкретной мутации в генетическом локусе или геноме организма. Поскольку мутации часто являются причиной наследственных и приобретенных заболеваний, важно делать статистический прогноз частоты возникновения определенных заболеваний в популяциях, для которых известна мутагенная экологическая обстановка.
Ионизирующее излучение. Ярко выраженным мутагенным действием обладают коротковолновое электромагнитное излучение (УФ-свет, рентгеновские лучи), а также элементарные частицы, образующиеся в процессе радиоактивного распада вещества. С помощью рентгеновского излучения Г. Меллером в 1927 г. впервые были получены мутации у дрозофилы. С тех пор исследования механизмов мутагенеза проводятся все интенсивнее и в широких масштабах.
Электромагнитное излучение, проходящее через вещество, или элементарные частицы передают свою энергию атомам. В результате первичного столкновения с квантами излучения или частицами из атома, который превращается в положительно заряженный ион, выбиваются электроны. Освобожденные электроны вторично вызывают образование пар ионов при перемещении до тех пор, пока их энергия не иссякнет и они не утратят свою ионизирующую способность. Единицей дозы излучения служит рентген (Р) – количество излучения, которое вызывает образование 2·109 пар ионов/см3 воздуха. На практике часто пользуются единицей рад, служащей мерой поглощения энергии; в воздухе 1 Р эквивалентен 0,876 рад. Для объяснения механизмов возникновения мутаций под действием ионизирующего излучения была применена ранее разработанная теория мишени, в соответствии с которой повреждение ДНК наблюдается в том месте, где имеет место первичная ионизация. Реакция происходит внутри дискретного объема, являющегося мишенью. Повреждения ДНК возникают как вследствие прямого попадания кванта излучения или элементарной частицы в молекулу, так и в результате вторичного действия иона, образовавшегося за пределами ДНК в некоем "чувствительном объеме". Установлено, что частота мутаций, возникающих у дрозофилы и других объектов, прямо пропорциональна дозе облучения. Определенная доза облучения вызывает одинаковое число мутаций как при однократном, так и при дробном облучении небольшими порциями.
Химические мутагены экзогенного происхождения. Многие химические соединения, встречающиеся в окружающей среде, обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. При этом одни химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК и изменяющими ее химическую структуру, а другие, так называемые промутагены, для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма.
Одним из наиболее обширных классов химических мутагенов экзогенного происхождения являются алкилирующие агенты, под действием которых происходит спонтанный (без участия ферментативных систем организма) перенос алкильных групп этих химических соединений на биологические макромолекулы, в том числе и ДНК. В табл. I.18 представлены основные классы алкилирующих агентов. В структурах химических соединений, приведенных в таблице, можно выявить различия по двум признакам, роль которых в мутагенной активности алкилирующих агентов была неоднократно подтверждена экспериментально. Один из признаков относится к типу переносимых алкильных групп: метильной, этильной или более сложной. Другой отличительный признак – число алкильных групп, которые отдает одна молекула алкилирующего агента. Это свойство называется функциональностью соединения. Так, среди азотистых ипритов H2NCH2CH2Cl – монофункционален, HN(CH2CH2Cl)2 – бифункционален, а N(CH2CH2Cl)3 – трифункционален.
Главным источником мутаций, возникающих под действием алкилирующих агентов, является алкилирование O-6 в гуанине и O-4 в тимине ДНК. Другими сайтами, алкилирование которых реже приводит к мутациям, могут быть N-3 гуанина, N-1, N-3 и N-7 аденина, N-3 цитозина, а также N-3 и N-4 тимина. При этом спектр мутаций, возникающих под действием любого алкилирующего агента, как правило, специфичен. Следует отметить, что благодаря функционированию репаративных систем клетки к возникновению мутаций приводит лишь небольшая часть алкилирований ДНК. Поэтому частота реакций между алкилирующим агентом и ДНК не связана простой зависимостью с их мутагенной активностью. То же самое относится не только к алкилирующим агентам, но и к другим мутагенам.
Таблица I.18