- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Геном эукариот
Как уже упоминалось выше, в отличие от прокариот основная часть генома эукариот находится в специальном клеточном компартменте (органелле), получившем название ядра, а значительно меньшая часть – в митохондриях, хлоропластах и других пластидах. Так же, как и у прокариот, информационной макромолекулой генома эукариот является ДНК, которая неравномерно распределена по нескольким хромосомам в виде комплексов с многочисленными белками. Эти ДНК-белковые комплексы эукариот получили название хроматина. На протяжении клеточного цикла хроматин претерпевает высокоупорядоченные структурные преобразования в виде последовательных конденсаций–деконденсаций. В соматических клетках при максимальной конденсации в метафазе митоза эти преобразования сопровождаются формированием видимых в микроскопе метафазных хромосом. Как морфология метафазных хромосом, так и их число являются уникальными характеристиками вида. Совокупность внешних признаков хромосомного набора эукариот получила название кариотипа. Эти признаки широко используются в биологической систематике.
Геном эукариот существенно отличается от генома прокариот по ряду признаков, среди которых необходимо отметить его избыточность. Содержание ДНК у эукариот в расчете на одну клетку в среднем на два–три порядка выше, чем у прокариот, и у разных видов животных изменяется от 168 пг (амфибии) до 1 пг (некоторые виды рыб). У человека имеется 6 пг ДНК на диплоидный геном, суммарная длина которой приближается к 6·109 п.о. (см. табл. I.1).
Повышенное содержание ДНК в геноме эукариот нельзя объяснить одним лишь увеличением потребности этих организмов в дополнительной генетической информации в связи с усложнением организации, поскольку большая часть их геномной ДНК, как правило, представлена некодирующими последовательностями нуклеотидов. Размер генома организмов, находящихся на более низких ступенях эволюционного развития, зачастую превышает размеры геномов более высокоорганизованных животных и растений. В настоящее время известно, что большая часть ДНК генома эукариот не кодирует РНК и белки, и ее генетические функции не вполне понятны. Особенности первичной структуры ДНК эукариот позволяют разделить ее на многочисленные семейства и классы, основные из которых кратко рассмотрены ниже.
Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, определенное на основании кинетики реассоциации фрагментированной ДНК, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15–98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина: не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. Хорошо известным примером таких уникальных последовательностей являются интроны, общий размер которых, как правило, на порядок и более превышает суммарный размер экзонов содержащих их генов.
Эволюционное возникновение мозаичной (интрон–экзонной) структуры генов эукариот, так же как и консервативный характер наследования размеров и взаимного расположения интронов в генах, не находит в настоящее время исчерпывающего объяснения из-за кажущегося отсутствия фактора давления естественного отбора на последовательности нуклеотидов без четких биологических функций. Наибольшее распространение получила концепция В. Гилберта (1977 г.), согласно которой появление интронов, по-видимому, совпавшее по времени с эволюционным возникновением многоклеточных организмов, обеспечило возможность обмена экзонами между неродственными генами (exon shuffling). Такой обмен должен сопровождаться образованием новых белков мозаичного строения, составленных из готовых полипептидных функционально значимых модулей (доменов), ранее принадлежавших другим белкам. Следствием этого, по мнению сторонников данной концепции, было резкое ускорение образования белков и ферментов с новыми функциями, а также глубокие эволюционные преобразования самих организмов, реализующих такие молекулярные механизмы. Эта точка зрения получила название "гипотезы позднего возникновения интронов" (intron late). В соответствии с другой гипотезой Дж.Е. Дарнелла и В.Ф. Дулиттла (1978 г.) современные интроны представляют собой "эволюционные реликты". Когда-то интроны были частью гигантских генов.
Не менее загадочным с эволюционной точки зрения остается и феномен появления в геноме многоклеточных организмов большого количества некодирующих повторяющихся последовательностей. Такие повторы представлены в гаплоидном геноме эукариот множественными копиями. В современной классификации повторов принято различать часто повторяющиеся последовательности, число которых превышает 105 на гаплоидный геном, и умеренно повторяющиеся, представленные 10–104 копиями. Хорошо изученным представителем первых является сателлитная ДНК, которая состоит из коротких тандемных повторов длиной 1–20 п.о., организованных в длинные блоки. Одними из первых среди повторяющихся последовательностей ДНК эукариот были открыты сателлитные ДНК тимуса телят. Свое название они получили на основании того, что при анализе суммарной эукариотической ДНК центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия они сопровождали основной пик оптической плотности в виде плеча (спутника, сателлита). Именно гомогенный нуклеотидный состав фракции сателлитных ДНК, определяемый наличием в ней многочисленных коротких повторов, изменял ее плавучую плотность, что легко обнаруживалось при центрифугировании. В своем классическом определении сателлитных ДНК Р.Д. Бриттен и соавт. (1974 г.) отмечали, что сателлиты – это минорный компонент ДНК, отделяющийся от основной ДНК при равновесном ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl. Для сателлитов характерен ряд свойств, среди которых наиболее важны: а) быстрая и точная реассоциация в процессе ренатурации ДНК; б) множество копий; в) простая первичная структура; г) гомогенный состав (протяженные кластеры одних и тех же повторяющихся блоков последовательны); д) пурин–пиримидиновая асимметрия в распределении нуклеотидов по цепям ДНК; е) концентрирование в прицентромерном гетерохроматине; ж) ограниченная репликация (недорипликация) при политенизации хромосом; з) нахождение в составе хромосом в виде тандемно (друг за другом) расположенных кластеров. Содержание сателлитной ДНК в геноме эукариот может достигать 5–50% от суммарного количества ДНК. Микро- (от 1 до 4 п.о. в основном повторяющемся блоке) и минисателлитные (с бóльшим числом п.о. в индивидуальном повторе) ДНК характеризуются высокой вариабельностью по числу копий в геномах организмов даже одного вида и в ряде случаев обладают генетической нестабильностью как в норме, так и при некоторых патологических состояниях организмов. Благодаря этому свойству мини- и микросателлиты часто называют тандемными повторами с изменяющимся числом копий VNTR (variable number of tandem repeats).
Другой тип повторов – диспергированные повторяющиеся последовательности ДНК, не организованные в крупные блоки, а рассеянные по геному. Повторы этого типа, иначе называемые умеренно повторяющимися последовательностями (medium reiterated frequency repeats – MERs), разделяют на два обширных класса: SINE (short interspersed elements) – короткие и LINE (long interspersed elements) – длинные диспергированные элементы. Длина SINE-элементов составляет 90–400 п.о., тогда как длина LINE-последовательностей может достигать 7 т.п.о. Хорошо изученными повторами класса SINE в геноме человека и некоторых приматов являются так называемые Alu-повторы, длина повторяющейся единицы которых составляет 300 п.о. Alu-повторы представлены в геноме человека ~106 копиями и в среднем встречаются через каждые 4 т.п.о., составляя ~5% от суммарного количества ДНК. Аналогичные в структурном отношении повторы, названные B1, обнаружены в геноме мышей и под другими названиями описаны у многих млекопитающих.
Хотя LINE-последовательности заключают в себе гены обратных транскриптаз, что является признаком ретротранспозонов (мобильных генетических элементов животных, обладающих структурным сходством с геномом ретровирусов), для них характерно отсутствие последовательностей длинных концевых повторов (long terminal repeats – LTR), типичных для ретротранспозонов (подробнее о геноме ретровирусов см. раздел 7.2.7). В качестве примера LINE-последовательности можно упомянуть LINE-1-повтор, широко распространенный в геноме животных. LINE-1-элемент мышей содержит две открытые рамки считывания ORF-1 и ORF-2, вторая из которых кодирует белок, гомологичный обратной транскриптазе. ORF фланкированы короткими нетранслируемыми последовательностями, а сами LINE-1 – короткими прямыми повторами (SDR). 5’-Концевые последовательности повтора функционируют в качестве промоторов транскрипции. Этот участок LINE-1 грызунов (но не человека) построен из коротких тандемных повторов двух типов A и F, называемых мономерами. Длина мономеров у крыс составляет 600 п.о. При этом A- (но не F) мономеры обладают активностью промоторов.
Так же как и сателлитные ДНК, SINE- и LINE-повторы характеризуются генетической нестабильностью. Их общими чертами являются транскрибируемость и способность к транспозициям. Последовательности РНК, транскрибированные с умеренных повторов, обнаруживают среди гетерогенных ядерных РНК, где их доля достигает 20–30%. Имеются экспериментальные свидетельства того, что новые копии повторяющихся элементов обоих типов возникают в геноме в результате функционирования механизма, названного ретротранспозицией, или ретропозицией. При участии подобного механизма под действием обратной транскриптазы сначала образуется кДНК на матрице РНК-транскрипта соответствующего повтора, которая далее интегрируется в новый локус генома, как это имеет место у ретровирусов. Такой механизм дает возможность локально изменять число копий определенных последовательностей нуклеотидов в эукариотическом геноме. Тем не менее, большая часть LINE-последовательностей неспособна к транспозициям, и их ORF, по-видимому, могут быть отнесены к псевдогенам – неэкспрессирующимся последовательностям, гомологичным последовательностям истинных генов. Помимо вышеупомянутых повторяющихся последовательностей геном человека содержит более 100 000 копий MaLR-повторов длиной в 2–3 т.п.о., содержащих LTR, и несколько тысяч последовательностей генома ретровирусов.
Несмотря на широкую распространенность повторяющихся и уникальных некодирующих последовательностей в геноме эукариот и их очевидную активность во время жизненного цикла организмов, биологическое значение этих и других некодирующих элементов генома остается непонятным. Вызывает сомнение правильность активно обсуждаемой в литературе гипотезы об "эгоистичности" избыточной геномной ДНК, в соответствии с которой вся избыточная ДНК является геномным паразитом и распространяется в геноме в результате транспозиций точных копий немногочисленных исходных последовательностей. Действительно, слишком велики были бы энергетические затраты на биосинтез предшественников ДНК и самой ДНК в клетках, в которых содержание "паразитической" ДНК в геноме на 2–3 порядка превышает количество функционально значимой ДНК, заключающей в себе последовательности нуклеотидов генов. Клетки с геномом, "зараженным" эгоистической ДНК, не смогли бы выдерживать конкуренции с клетками, не содержащими "паразита", из-за значительного возрастания энергетических затрат на редупликацию генома. Кроме того, концепция эгоистической ДНК, в соответствии с которой предполагается отсутствие эволюционного давления отбора на "паразитические" последовательности нуклеотидов, не объясняет высокую консервативность мест локализации и размеров интронов в гомологичных генах филогенетически близких организмов, а также не указывает на механизм, поддерживающий число копий повторов на относительно постоянном уровне в ряду поколений организмов. Такого рода концепции не могут ответить на вопрос: где же предел, до которого может самопроизвольно увеличиваться размер генома клетки-хозяина в филогенезе?
Функциональную значимость избыточной ДНК лишь частично объясняют концепции, приписывающие ей структурную роль в пространственной организации генома и участие в конъюгации гомологичных хромосом в мейозе или репликации теломерных участков хромосом. Таким образом, основные положения знаменитого парадокса C, указывающие на необъяснимое присутствие в геноме эукариотических организмов большого количества избыточной ДНК, по-прежнему остаются загадочными и парадоксальными. Попытка нового объяснения основной функциональной роли "избыточной" ДНК в геноме эукариот сделана в разделе 5.3.