- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
Для того чтобы терапевтическое действие трансгенов реализовывалось в полной мере, часто бывает необходимо обеспечивать их тканеспецифическую экспрессию в клетках-мишенях на протяжении всей жизни индивидуума. Из-за ограниченной емкости современных векторов, используемых для адресной доставки трансгенов, не представляется возможным применение для регуляции экспрессии энхансеров и сайленсеров, которые в норме чаще всего создают условия для тканеспецифического характера экспрессии генов в их обычном генетическом окружении (подробнее см. раздел 3.2). Из экспериментов с трансгенными животными известно, что для эффективной экспрессии трансгена часто требуется присутствие его интронов. Более того, чтобы предотвратить возмущающее действие регуляторных элементов хромосом клеток-хозяев, необходимо включать в трансген протяженные фланкирующие последовательности. В частности, для достижения полного уровня экспрессии кластера глобиновых трансгенов требовалось фланкировать кластер некодирующей 5’-концевой последовательностью -глобинового гена и 3’-концевой последовательностью -глобинового гена длиной в 20 т.п.о. каждая. Таким образом, для достижения полного уровня экспрессии трансгена необходимо вводить в клетки-мишени фрагменты геномной ДНК длиной в 250 т.п.о. и более, что является трудновыполнимой задачей. Для исключения интерференции эндогенных регуляторных элементов с таковыми трансгенов часто требуется присутствие в генно-инженерных конструкциях специальных регуляторных элементов – инсуляторов (см. раздел 3.2.4), которые должны предотвращать действие гетерологичных энхансеров на трансгены. При этом необходимо иметь в виду, что инсуляторы не оказывают защитного действия на экспрессию трансгенов, не интегрированных в хромосому клетки-реципиента. Таково в самых общих чертах генетическое окружение трансгена, действие которого необходимо учитывать при создании соответствующих генно-инженерных конструкций. Однако имеются и другие, лучше изученные механизмы, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию трансгенов.
Тканеспецифические промоторы. Обеспечение тканеспецифической экспрессии трансгена может достигаться путем использования в генно-инженерных конструкциях тканеспецифических промоторов, которые содержат регуляторные элементы, обеспечивающие избирательную транскрипцию гена в определенных тканях. В связи с этим повышенный интерес вызывают промоторы гена регулятора трансмембранной проводимости кистозного фиброза (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – CFTR) и различных генов, специфически экспрессирующихся в мышечных тканях. Установлено, что фрагмент ДНК длиной в 2 т.п.о., фланкирующий ген CFTR с 5’-конца, обеспечивает, хотя и на низком уровне, экспрессию трансгенов в клетках дыхательных путей человека и мышей как in vitro, так и in vivo. Аналогичного эффекта удалось достичь с использованием промотора гена -актина скелетных мышц и энхансера гена легкой цепи миозина в составе ретровирусных векторов. Эксперименты такого рода приближают то время, когда экспрессия трансгенов в процессе генотерапии будет строго управляемой и тканеспецифической, что является необходимым условием использования генотерапии для лечения заболеваний человека.
Промоторы, активируемые в клетках опухолей. Описано несколько случаев, когда клетки опухолевых тканей обеспечивают более высокий уровень экспрессии определенных генов по сравнению с соответствующими клетками здоровых тканей, что достигается повышением уровня активности их промоторов. Это явилось основанием для разработки одной из стратегий генотерапии рака. Например, многие меланомы характеризуются высоким уровнем синтеза меланина, что связано с активацией промоторов гена тирозиназы и генов, ассоциированных с тирозиназой белков TRP-1 и TRP-2. Эти промоторы, специфически активирующиеся в раковых клетках, были использованы для обеспечения тканеспецифической экспрессии гена-активатора предшественников цитостатиков. Другим примером является раковый эмбриональный антиген (carcinoembryonic antigen – CEA) – специфический маркер опухолевых клеток, локализованный на их поверхности. Экспрессия этого белка регулируется на уровне транскрипции. Регуляторные последовательности его гена также были использованы для избирательной активации предшественников цитостатиков в раковых клетках через активацию соответствующего гена. Аналогичные результаты были получены и с использованием регуляторных элементов онкогенов, усиленно экспрессирующихся в опухолевых тканях. Подробнее о терапевтическом использовании этого подхода см. ниже.
Направленная интеграция трансгенов в определенные генетические локусы. Альтернативным, хотя и более трудоемким, подходом к достижению избирательной экспрессии трансгенов является их введение сразу под контроль эндогенных регуляторных элементов клеток-мишеней, которые присутствуют в сайте интеграции. Известно, что адено- ассоциированный вирус дикого типа осуществляет сайт-специфическую интеграцию своего генома в хромосому 19 человека и что такая специфичность сохраняется и в ряде генно-инженерных конструкций, полученных с его использованием. Однако векторы на основе ДНК адено-ассоциированных вирусов не могут нести вставку, размер которой превышает 2,5 т.п.о., что ограничивает их практическое использование.