- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Биосинтез белка рибосомами бактерий
В процесс биосинтеза белка рибосомами, называемого трансляцией, вовлечено множество макромолекул и макромолекулярных комплексов. На этом этапе реализации генетической информации происходит считывание генетической информации, заключенной в мРНК, рибосомами и ее передача полипептидным цепям белков, т.е. биосинтез полипептидных цепей, последовательность аминокислот в которых, как правило, однозначно определена последовательностью нуклеотидов в транслируемых мРНК в соответствии с генетическим кодом. Свободные аминокислоты не узнаются рибосомами. Чтобы это произошло, аминокислоты должны поступать в рибосомы в виде конъюгатов с тРНК (аминоацилированных тРНК), последовательности нуклеотидов которых распознаются аппаратом трансляции. В каждой молекуле тРНК имеется участок из трех нуклеотидов, комплементарный кодону мРНК. Именно эта последовательность, называемая антикодоном, в основном определяет положение той или иной аминокислоты в полипептидной цепи. В ходе каждого индивидуального акта трансляции рибосома распознает кодон мРНК и в соответствии с ним выбирает аминоацилированную тРНК, антикодон которой соответствует транслируемому кодону. После этого происходит соединение посредством пептидной связи очередной аминокислоты с С-концевой аминокислотой растущей цепи полипептида.
Таким образом, во время трансляции рибосома после связывания мРНК начинает последовательно, кодон за кодоном, перемещаться вдоль матрицы, выбирая из окружающей среды молекулы аминоацилированных тРНК. При этом каждый индивидуальный акт трансляции завершается присоединением выбранной молекулы аминокислоты к С-концевой аминокислоте синтезируемой цепи белка посредством пептидной связи. Ниже более подробно будут рассмотрены основные этапы биосинтеза белка и компоненты белоксинтезирующей системы бактерий.
Рибосомы
Рибосомы представляют собой крупный рибонуклеопротеидный комплекс с молекулярной массой 2,5 мДа, состоящий из рибосомных белков, молекул рРНК и ассоциированных с ними факторов трансляции. Рибосомы прокариотических и эукариотических организмов различаются по размерам. У эукариот они представлены 80S частицами, тогда как коэффициент седиментации рибосом прокариот составляет 70S. Рибосомы всех известных организмов построены из двух неравных субчастиц: прокариотические – 30S и 50S, а эукариотические – 40S и 60S. 70S рибосомы эубактерий в своем составе содержат 55–60 рибосомных белков, для 80S рибосом эукариот это число составляет 75–85. В обоих случаях рибосомные белки в составе рибосом ассоциированы с молекулами рРНК, образуя пространственно организованные рибонуклеопротеиновые тяжи.
Рибосомные белки E. coli. В настоящее время более 50 рибосомных белков выделено в высокоочищенном состоянии. Молекулярная масса самого маленького белка составляет 5 кДа, а самого большого – 61 кДа, тогда как для большинства рибосомных белков эти значения лежат в пределах 10–20 кДа. Определены аминокислотные последовательности полипептидных цепей всех рибосомных белков E. coli. Малая рибосомная субчастица содержит 21 белок с суммарной молекулярной массой 350 кДа.
Белки в составе 30S субчастицы ассоциированы с 16S РНК, длина которой составляет 1542 нуклеотида (нт). Суммарные молекулярные массы малой и большой субчастиц рибосом достигают соответственно 850 и 1450 кДа. Третья часть массы большой субчастицы приходится на 34 рибосомных белка, а две третьих – на 23S (2904 нт) и 5S рРНК (120 нт). Продолжают накапливаться биохимические данные, указывающие на центральную, возможно ключевую, роль рРНК в обеспечении этапов трансляции. Обнаружены специфические внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия между различными функциональными участками рРНК. На прямое участие 23S рРНК в трансляции указывает наличие специфических комплементарных взаимодействий между ней и CCA-концами тРНК, акцептирующими аминокислотные остатки. В уточненных пространственных моделях 30S и 50S субчастиц, рассмотренных ниже, сегменты рРНК со специфическими структурными особенностями располагаются в функционально значимых участках рибосом.
Методы исследования пространственной структуры рибосом. Вся информация о пространственной структуре рибосом получена с использованием современных методов, в которых реализуются два направления исследований: структурно-биологические исследования низкого и высокого разрешения, а также биохимические – высокого разрешения. Получаемые результаты, по мере совершенствования методов, все более сближаются друг с другом.
Рис. I.17. Карта сборки 50S субчастицы рибосом E. coli из индивидуальных рибосомных белков и рРНК в процессе реконструкции in vitro
Стрелками обозначены межмолекулярные взаимодействия, удерживающие индивидуальные белки (цифры в кружках) в составе субчастицы, и взаимозависимость сборки. Толщина стрелок отражает прочность связей
Одними из первых следует упомянуть кристаллографию и ЯМР-спектроскопию. Имеются значительные достижения в изучении пространственной структуры небольших субдоменов рРНК с помощью ЯМР-спектроскопии, а также в исследовании структуры индивидуальных рибосомных белков с использованием методов ЯМР и кристаллографии. В последнее время закристаллизованы отдельные рибосомные субчастицы и 70S рибосомы галофильных и термофильных бактерий. Получены картины дифракции для 50S субчастиц галофилов с разрешением 3Å, а также рибосом и субчастиц T. thermophilus с разрешением 7–20 Å. Однако эти картины дифракции, по крайней мере, в 10 раз сложнее тех, с которыми приходилось иметь дело раньше при расшифровке структур несимметричных макромолекул, что сильно затрудняет их интерпретацию. В результате наиболее распространена в настоящее время альтернативная стратегия определения структуры рибосом "по частям": через пространственные структуры индивидуальных рибосомных белков, субдоменов рРНК и их небольших комплексов. Выявленное в ходе этих исследований большое разнообразие пространственных структур рибосомных белков указывает на существование не менее разнообразных механизмов распознавания белками специфических участков РНК, количество которых должно значительно превышать ограниченное число известных механизмов ДНК–белкового узнавания.
Рис. I.18. Полупрозрачная модель пространственной структуры рибосомы E. coli (а) и расположение рибосомных белков, а также рРНК в ее 30S-субчастице (б)
Указано положение мРНК, тРНК в А-, Р- и Е-участках рибосомы, белка L1 и "выступа" (stalk) 50S субчастицы. Черными шарами обозначены рибосомные белки, светлыми цилиндрами – спиральные участки 16S рРНК, стрелками – места связывания мРНК, тРНК и антибиотиков, цифрами – рибосомные белки и участки рРНК согласно общепринятой номенклатуре
Другим плодотворным направлением исследования пространственной структуры рибосом при низком разрешении является электронная микроскопия (ЭМ). При этом образцы с рибосомами быстро замораживают в жидком этане в тонком слое буфера и исследуют с помощью ЭМ при температуре жидкого азота и низких дозах облучения для сохранения чувствительных к радиации структур в интактном состоянии. На получаемых в результате микрофотографиях могут одновременно содержаться сотни и тысячи по-разному ориентированных индивидуальных рибосом, изображения которых далее подвергаются компьютерному анализу с последующей реконструкцией трехмерной структуры индивидуальной рибосомной частицы. Реконструкцию трехмерных структур работающих рибосом получают в результате анализа микрофотографий ультратонких срезов отдельных бактериальных клеток, активно синтезировавших белок или находившихся в состоянии блока трансляции. Одной из разновидностей ЭМ, активно использующейся для исследования пространственной структуры рибосом, является иммуноэлектронная микроскопия. Первичные и пространственные структуры рибосомных белков, формирующие их эпитопы, значительно различаются, поэтому такие белки редко дают перекрестные иммунологические реакции и их можно четко идентифицировать с помощью специфических антител. При анализе комплексов антител с рибосомами с помощью электронной микроскопии можно видеть, что многие белки локализованы на поверхности рибосомных субчастиц. Оказалось, что пространственное расположение большинства рибосомных белков весьма консервативно. В частности, у грамположительных и грамотрицательных бактерий гомологичные белки занимают одни и те же места на поверхности рибосомных субчастиц.
Важная информация о расположении индивидуальных рибосомных белков в составе рибосом получена и с помощью метода поперечных сшивок. Используя бифункциональные реагенты, например диэпоксибутан или 2-иминотиолан, осуществляют ковалентное соединение рибосомных белков, расположенных по соседству на расстоянии 5–10 Å друг от друга. Поскольку в настоящее время аминокислотные последовательности всех рибосомных белков известны, этим методом можно однозначно определять, какие аминокислотные остатки в соседних белках участвуют в образовании поперечных сшивок.
Целостность рибосом в водных растворах в значительной степени зависит от температуры и ионных условий, особенно от концентрации двухвалентных ионов (Mg2+ и Ca2+). Понижение концентрации ионов Mg2+ приводит вначале к диссоциации рибосом на большую и малую субчастицы, а затем к последовательному упорядоченному освобождению рибосомных белков из субчастиц вплоть до их полного распада с образованием пула отдельных белков и рРНК. Процесс разборки рибосом обратим, и при восстановлении ионных и температурных условий в реакционной смеси возможно реконструирование рибосомных субчастиц из отдельных компонентов с образованием полноценных функционально активных рибосом. На рис. I.17 представлена карта сборки большой субчастицы рибосом E. coli из отдельных компонентов, которая отражает последовательность присоединения рибосомных белков к рРНК, а также два основных этапа сборки. Для перехода ко второму этапу необходимо дальнейшее изменение ионных условий и температуры реакционной среды. Процесс сборки субчастиц рибосом является кооперативным, т.е. присоединение одних рибосомных белков стимулирует включение других. При этом белки, включающиеся в состав рибосомных субчастиц друг за другом, в зрелых субчастицах оказываются расположенными рядом. Реконструирование рибосом из отдельных компонентов in vitro внесло большой вклад в понимание пространственной организации рибосомных субчастиц и функциональной значимости отдельных рибосомных белков.
Метод рассеяния нейтронов на протонах, входящих в состав белков, также способствовал пониманию пространственного расположения белков в рибосомах. Отклонения нейтронов после контактов с протонами белков можно легко отличить от отклонений, которые являются результатом взаимодействия нейтронов с другими атомами, в частности тяжелыми изотопами водорода (2H или 3Н). Если в состав дейтерированных рибосомных субчастиц ввести два рибосомных белка, содержащих обычные протоны, то по рассеянию нейтронов на протонах, характер которого значительно отличается от такового на дейтронах, можно определить расстояния между центрами масс этих двух белков. Усовершенствованный метод нейтронного рассеяния позволяет определять не только расстояния между рибосомными белками, но и пространственную организацию самих полипептидных цепей в составе рибосомных субчастиц. Полученные таким образом нейтронные карты основаны на измерении расстояний между 93 белками. Такие карты имеют фундаментальное значение в интерпретации экспериментальных данных, полученных другими методами, особенно в результате молекулярного моделирования.
При отсутствии данных рентгеноструктурного анализа высокого разрешения молекулярные биологи традиционно обращаются к молекулярному моделированию пространственных структур. В некоторых случаях такой подход бывает весьма успешным, что особенно ярко проявилось при расшифровке пространственной структуры ДНК. Все модели, описанные в настоящее время, учитывают филогенетические особенности вторичной структуры 16S рРНК, и в некоторых из них принимаются во внимание третичные взаимодействия внутри этих макромолекул. В последнее время для таких целей все чаще используется компьютерный анализ. Применение вычислительной техники сводит к минимуму субъективизм в построении моделей и позволяет систематически исследовать возможные конформационные состояния анализируемых молекулярных объектов. При этом выбор конкретного алгоритма в современном моделировании оказывает меньшее влияние на конечный результат, чем выбор имеющихся экспериментальных данных и использование ограничивающих условий.
На рис. I.18 представлена современная модель пространственной структуры 70S рибосомы E. coli, разработанная в лаборатории Д. Франка (США) с учетом данных, которые были получены с помощью всех вышеперечисленных методов.