9. Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы

Антисмысловые РНК как ключевые компоненты одной из систем негативной регуляции экспрессии генов были впервые описаны у бактерий. Вскоре тот же тип регуляции был обнаружен и у эукариот. Уже в первых опытах было установлено, что короткие РНК, комплементарные мРНК, образуют с ними гибриды и блокируют трансляцию. Поскольку действие таких РНК направлено против функционирования кодирующих (осмысленных) РНК, они получили название антисмысловых (antisense RNA), или micРНК (mRNA interfering complementary RNA). Это открытие вскоре легло в основу целого направления исследований искусственной регуляции экспрессии генов, неразрывно связанного с методами генной инженерии.

1. Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды

Главный механизм, лежащий в основе функционирования системы антисмысловых РНК, прост и опирается на известный феномен взаимодействия двух комплементарных друг другу молекул нуклеиновых кислот с образованием двухцепочечных РНК–РНК- или ДНК–РНК-гибридов. Оказалось, что взаимодействие с мРНК комплементарного ей полинуклеотида или олигонуклеотида (которые могут быть транскриптами незначащей цепи ДНК, т.е. противоположной той, с которой произошла транскрипция этой мРНК) может блокировать ее трансляцию рибосомами и нарушать экспрессию всего гена на уровне трансляции.

В середине 1970-х годов синтетические олигонуклеотиды, комплементарные мРНК, были впервые использованы в бесклеточных системах биосинтеза белка для подавления трансляции этих мРНК. С разработкой современных методов генной инженерии получение антисмысловых РНК упростилось, так как достаточно в экспрессирующем векторе поместить кодирующую последовательность гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы начала транскрибироваться незначащая цепь ДНК с образованием антисмысловой РНК. В такой системе с использованием современных векторов, в которых клонируемая последовательность фланкирована промоторами T3-, T7- или SP6-РНК-полимераз (например вектор Bluescript, см. рис. II.5), можно синтезировать большое количество антисмысловых РНК и использовать их в высокоочищенном состоянии в опытах in vitro. Однако современные генно-инженерные конструкции позволяют вводить векторные молекулы, экспрессирующие антисмысловые РНК, непосредственно в клетки живых организмов и наблюдать биологические эффекты антисмысловых РНК в результате их эндогенной экспрессии.

1. Механизм действия антисмысловых рнк

Многочисленные исследования антисмысловых РНК как in vitro, так и in vivo показали, что конечным результатом их действия, как правило, является высокоспецифическое ослабление экспрессии генов, мРНК которых является мишенью действия антисмысловых РНК. При использовании олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным частям мРНК, было установлено, что как в бесклеточных экстрактах, так и в эукариотических клетках подавление трансляции мРНК достигалось главным образом за счет ее расщепления РНКазой H в месте образования РНК–ДНК-гибрида. При этом бесклеточные экстракты зародышей пшеницы были особенно богаты РНКазой H, однако процесс специфического расщепления мРНК эффективно происходил и в ооцитах Xenopus, и в культивируемых клетках животных. Интересным следствием такого рода исследований оказалось то, что даже экзогенно добавленные к культивируемым клеткам олигодезоксирибонуклеотиды проникали внутрь клеток и блокировали трансляцию соответствующих мРНК.

Механизм транспорта олигонуклеотидов в клетки обладает чертами сходства с эндоцитозом, опосредованным рецепторами. Эффект подавления трансляции мРНК специфическими комплементарными нуклеотидами достигался, как правило, лишь при большом молярном избытке олигонуклеотидов по отношению к мРНК, что является следствием их относительно медленной реассоциации и быстрой внутриклеточной деградации олигонуклеотидов (время полужизни в ооцитах менее 20 мин). Расщепление гибридов мРНК с олигодезоксирибонуклеотидами – не единственный механизм ингибирующего действия олигонуклеотидов на трансляцию. Использование метилфосфонатных (-P-CH₃) аналогов олигонуклеотидов, гибриды которых с РНК не расщепляются РНКазой H, показало, что их действие может быть следствием изменения пространственной структуры мРНК, а также нарушения ее связывания рибосомами. При этом олигонуклеотиды, в которых чередуются фосфодиэфирные и метилфосфонатные связи, сохраняли способность индуцировать расщепление мРНК РНКазой H в гибридах и в то же время характеризовались повышенной устойчивостью к действию внутриклеточных нуклеаз.

Использование аналогов олигодезоксирибонуклеотидов повышает результативность действия системы ингибирования трансляции. Еще более эффективными являются системы, в которых определенный уровень антисмысловых РНК непрерывно поддерживается за счет их эндогенного синтеза, а с мРНК взаимодействуют более протяженные комплементарные последовательности нуклеотидов.

Механизмы ингибирующего действия антисмысловых РНК. В первых опытах с антисмысловыми РНК, которые с помощью микроинъекции вводили в ооциты X. laevis, было установлено, что они подавляют трансляцию соответствующих мРНК. В том случае, если антисмысловые РНК, комплементарные мРНК креатинкиназы В человека, синтезировались в ядрах клеток лимфомы человека, сплайсинг, 3’-концевой процессинг и экспорт соответствующих мРНК в цитоплазму не были нарушены, хотя антисмысловые РНК синтезировалась в эквимолярных количествах по отношению к мРНК-мишени, а сама антисмысловая РНК была комплементарна последовательностям нуклеотидов части последнего кодирующего экзона, соседнего интрона и 3’-фланкирующей последовательности. Экспорт антисмысловой РНК из ядра в цитоплазму был несколько снижен по сравнению с соответствующей мРНК, хотя при этом происходило уменьшение внутриклеточной активности креатинкиназы на 40%. Образование дуплекса между антисмысловой РНК и мРНК, по-видимому, сопровождалось ингибированием связывания мРНК рибосомами, а также транслокации рибосом в процессе трансляции. Взаимодействие антисмысловых РНК с 5’-концевыми нетранслируемыми последовательностями мРНК может изменять пространственную структуру мРНК таким образом, что инициирующий AUG-кодон становится недоступным рибосомам. Не исключено, что в ряде случаев антисмысловые РНК могут блокировать экспорт мРНК из ядра в цитоплазму, особенно когда они присутствуют в молярном избытке. Это также может быть одной из причин подавления синтеза соответствующих белков.

Наилучшие результаты по блокированию экспрессии генов были получены в том случае, когда гены антисмысловых РНК находились в клетках в виде множественных экспрессируемых копий, встроенных в геном, или под контролем сильных промоторов. Дуплексы антисмысловых РНК и мРНК, образующиеся в клетках, которые экспрессируют антисмысловые РНК, являются субстратом для расплетающего фермента (unwindase), который присутствует в клетках всех типов тканей животных. Расплетающий фермент производит дезаминирование 25–40% остатков аденина в обеих цепях дуплекса с образованием инозина. Остатки инозина образуют комплементарные пары с остатками гуанина, поэтому в процессе такой модификации происходит изменение кодирующих свойств мРНК и ее трансляция может приводить к образованию нефункциональных белков. Таким образом, и в данном случае антисмысловые РНК опосредуют инактивацию комплементарных им мРНК, что является еще одним механизмом их ингибирующего действия на экспрессию генов.