8. Направленный мутагенез и белковая инженерия

Многие мутации сопровождаются изменениями фенотипа мутантного организма на морфологическом или биохимическом уровне, хорошо различимыми визуально или с помощью биохимических методов. Такие мутационные изменения называют генетическими маркерами мутантного организма, так как они позволяют отличать мутанты от нормальных особей и прослеживать передачу мутантных генов в ряду поколений. Именно эта возможность следить за судьбой мутантных генов в потомстве, получаемом от скрещиваний родительских мутантных организмов, позволила в свое время создать мощное научное направление, называемое формальной генетикой, основанное на генетическом анализе наследования мутантных признаков.

До развития генной инженерии гены исследовали преимущественно методами генетического анализа с использованием мутантных признаков организмов в качестве генетических маркеров. Это давало возможность определения границ генов и построения их подробных генетических карт. Именно потребности генетического анализа привели к быстрому развитию классических методов получения мутаций: чем больше имеется мутаций в определенном гене, тем более подробную генетическую карту такого гена можно построить. Классические методы получения мутаций в конкретных генах основаны на отборе мутантных организмов в селектируемых условиях (например по устойчивости к антибиотикам) из большого числа организмов дикого типа и мутантных организмов, несущих мутации в других генах. После получения искомого мутантного организма можно локализовать мутацию на генетической карте и биохимическими методами исследовать ее проявление на молекулярном уровне. Например, с использованием очищенного мутантного фермента можно определить молекулярные изменения, приводящие к формированию мутантного фенотипа. Этот традиционный подход, не забытый окончательно и сегодня, дал очень много для развития классической и молекулярной генетики. Однако из-за низкой эффективности и большой трудоемкости метода его было трудно использовать для исследования высших организмов.

1. Методы направленного получения мутаций

Развитие генной инженерии революционизировало процесс получения мутаций в конкретных участках генома и анализ последствий этих мутаций на молекулярном уровне. Совокупность методов получения мутаций, основанных на использовании генно-инженерных подходов, называют направленным, или сайт-специфическим мутагенезом. Прообразом направленного мутагенеза является простая обработка клонированного гена химическими мутагенами in vitro, которая приводит к четкой локализации возникающих мутаций в пределах этого гена. В настоящее время разработано много эффективных методов сайт-специфического мутагенеза, позволяющих сознательно производить мутационные замены конкретных нуклеотидов. Направленное получение мутаций в сегментах рекомбинантных генов, введение мутантных генов в организм и исследование влияния полученных мутаций на функционирование гена – этот подход прямо противоположен классическим методам получения мутаций. Совокупность таких подходов получила название обратной генетики. Кроме того, возможность замены конкретных аминокислот в белках с известной первичной структурой, а также объединение в одной полипептидной цепи доменов различных белков и ферментов позволили, по сути дела, конструировать in vitro новые белки, не встречающиеся в природе, и привели к созданию в молекулярной генетике нового направления – белковой инженерии. В следующих разделах этой главы будут рассмотрены основные методы направленного мутагенеза и белковой инженерии, а также некоторые впечатляющие результаты, полученные с применением этих методов.