- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Аптамеры
Аптамераминазывают небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекцииinvitro, используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными лигандами. Такие соединения находят применение в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с лигандами, и их начинают использовать для обнаружения повреждений в ДНК, для воздействия на экспрессию генов, а также в качестве модулей при конструировании рибозимов, обладающих аллостерическими свойствами. В настоящее время получены аптамеры как рибо-, так и дезоксирибонуклеотидной природы, которые образуют специфические комплексы с разнообразными химическими соединениями, включая большинство аминокислот, нуклеотиды и их производные, антибиотики, биологически активные пептиды, органические красители, дофамин, теофиллин, и многие другие органические соединения, имеющие биологическое значение. Приведем несколько примеров, иллюстрирующих последние достижения в этой области исследований.
Аптамеры, взаимодействующие с красителями. Недавно была реализована идея использования аптамеров для введения флуоресцентной метки в молекулы РНК, синтезируемыеin vivo, для наблюдения за экспрессией соответствующих генов. Из пула случайных последовательностей были выделены ~60-звенные олигорибонуклеотиды, специфически взаимодействующие с сульфородаминомB. После введения в аптамеры мутаций и повторной селекции удалось получить олигонуклеотиды, взаимодействующие с флуоресцеином. В иммобилизованном состоянии эти аптамеры специфически связывали флуоресцентные красители и не давали перекрестных реакций.
В другой серии исследований были идентифицированы аптамеры, взаимодействующие с красителем HoechstH33258, которые функционировали какin vitro, так иin vivo. Последовательности аптамеров в форме кДНК встраивали в виде тандемных повторов в нетранслируемую область гена ß-галактозидазы, находящегося в составе экспрессирующего вектора. Вектор вводили с помощью трансфекции в клетки линииCHO, которые далее выращивали в присутствии красителя. При определении активности ß-галактозидазы через 24 ч после трансфекции установили, что ее синтез не происходил еслиHoechstH33258 присутствовал в питательной среде в концентрации 5–10 мM.
Аптамеры, взаимодействующие с небольшими молекулами биологического происхождения. В качестве первого этапа серии исследований по созданию аптамеров, которые бы специфически распознавали олигосахариды поверхности клеток, недавно (1998 г.) были получены олигодезоксирибонуклеотиды, специфичные в отношении дисахарида целлобиозы. Для скрининга аптамеров использовали простую и эффективную методику. Библиотеку олигонуклеотидов инкубировали с целлюлозой, цепи молекул которой построены из целлобиозы, и несвязавшиеся олигонуклеотиды отмывали буферным раствором, а оставшиеся в комплексе – элюировали раствором целлобиозы. Оказалось, что полученные аптамеры специфически распознают целлобиозу как в растворе, так и в составе целлюлозы (Kd = 10–0,1 мкM) и не взаимодействуют с родственными дисахаридами: мальтозой, лактозой и гентиобиозой. Такие результаты создают предпосылки для получения полного набора олигонуклеотидных рецепторов, который можно было бы использовать в технологии микроматриц ДНК для идентификации антигенов поверхности клеток, что весьма актуально, в частности для осуществления пересадки органов и тканей.
Другим впечатляющим результатом этого направления исследований было недавнее получение аптамеров, которые обладали в 1000 раз большим сродством к N-7-метилгуанозину (основному компоненту кэп-групп мРНК эукариот), чем к его неметилированному аналогу. Такие аптамеры специфически ингибировали трансляцию мРНК, содержащих кэп-группы, в бесклеточных системах, полученных из клеток HeLa или дрожжей. Полагают, что такие аптамеры найдут применение в исследовании кэп-зависимых процессов метаболизма эукариотических мРНК, например сплайсинга пре-мРНК или их транспорта из ядра в цитоплазму.
С помощью аптамеров, специфичных в отношении 7,8-дигидро-8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, который возникает при повреждении ДНК радикалами кислорода, удавалось обнаруживать в ДНК одну такую молекулу среди 104 обычных остатков дезоксигуанозина. Аналогичные аптамеры могут быть потенциально использованы для мониторинга мутагенных последствий окислительного стресса в эукариотических клетках.
Перспективы использования аптамеров. Новейшие результаты, полученные с использованием аптамеров, указывают на возможность их применения в ближайшем будущем в биотехнологии для регулируемой экспрессии генов, а также для диагностики и терапии. Одним из наиболее интересных достижений в этой области исследований является создание рибозимов с аллостерическими свойствами. В таких конструкциях каталитический домен рибозима соединяют с последовательностями аптамеров-рецепторов, взаимодействующих с регуляторными молекулами. В присутствии низкомолекулярных регуляторов может происходить специфическая активация или ингибирование ферментативной активности рибозима. Такие гибридные конструкции получили название аптазимов. Недавно полученный аптазим, обладающий РНК-лигазной активностью, активировался в 105 раз в присутствии специфических низкомолекулярных эффекторов. При аналогичном подходе были сконструированы ATP-зависимые рибозимы.
Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с известными молекулами биогенного происхождения, например белками ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и NAD+.