Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
gene_expression.doc
Скачиваний:
382
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
6.12 Mб
Скачать
    1. Аптамеры

Аптамераминазывают небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекцииinvitro, используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными лигандами. Такие соединения находят применение в фундаментальных исследованиях молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот с лигандами, и их начинают использовать для обнаружения повреждений в ДНК, для воздействия на экспрессию генов, а также в качестве модулей при конструировании рибозимов, обладающих аллостерическими свойствами. В настоящее время получены аптамеры как рибо-, так и дезоксирибонуклеотидной природы, которые образуют специфические комплексы с разнообразными химическими соединениями, включая большинство аминокислот, нуклеотиды и их производные, антибиотики, биологически активные пептиды, органические красители, дофамин, теофиллин, и многие другие органические соединения, имеющие биологическое значение. Приведем несколько примеров, иллюстрирующих последние достижения в этой области исследований.

Аптамеры, взаимодействующие с красителями. Недавно была реализована идея использования аптамеров для введения флуоресцентной метки в молекулы РНК, синтезируемыеin vivo, для наблюдения за экспрессией соответствующих генов. Из пула случайных последовательностей были выделены ~60-звенные олигорибонуклеотиды, специфически взаимодействующие с сульфородаминомB. После введения в аптамеры мутаций и повторной селекции удалось получить олигонуклеотиды, взаимодействующие с флуоресцеином. В иммобилизованном состоянии эти аптамеры специфически связывали флуоресцентные красители и не давали перекрестных реакций.

В другой серии исследований были идентифицированы аптамеры, взаимодействующие с красителем HoechstH33258, которые функционировали какin vitro, так иin vivo. Последовательности аптамеров в форме кДНК встраивали в виде тандемных повторов в нетранслируемую область гена ß-галактозидазы, находящегося в составе экспрессирующего вектора. Вектор вводили с помощью трансфекции в клетки линииCHO, которые далее выращивали в присутствии красителя. При определении активности ß-галактозидазы через 24 ч после трансфекции установили, что ее синтез не происходил еслиHoechstH33258 присутствовал в питательной среде в концентрации 5–10 мM.

Аптамеры, взаимодействующие с небольшими молекулами биологического происхождения. В качестве первого этапа серии исследований по созданию аптамеров, которые бы специфически распознавали олигосахариды поверхности клеток, недавно (1998 г.) были получены олигодезоксирибонуклеотиды, специфичные в отношении дисахарида целлобиозы. Для скрининга аптамеров использовали простую и эффективную методику. Библиотеку олигонуклеотидов инкубировали с целлюлозой, цепи молекул которой построены из целлобиозы, и несвязавшиеся олигонуклеотиды отмывали буферным раствором, а оставшиеся в комплексе – элюировали раствором целлобиозы. Оказалось, что полученные аптамеры специфически распознают целлобиозу как в растворе, так и в составе целлюлозы (Kd = 100,1 мкM) и не взаимодействуют с родственными дисахаридами: мальтозой, лактозой и гентиобиозой. Такие результаты создают предпосылки для получения полного набора олигонуклеотидных рецепторов, который можно было бы использовать в технологии микроматриц ДНК для идентификации антигенов поверхности клеток, что весьма актуально, в частности для осуществления пересадки органов и тканей.

Другим впечатляющим результатом этого направления исследований было недавнее получение аптамеров, которые обладали в 1000 раз большим сродством к N-7-метилгуанозину (основному компоненту кэп-групп мРНК эукариот), чем к его неметилированному аналогу. Такие аптамеры специфически ингибировали трансляцию мРНК, содержащих кэп-группы, в бесклеточных системах, полученных из клеток HeLa или дрожжей. Полагают, что такие аптамеры найдут применение в исследовании кэп-зависимых процессов метаболизма эукариотических мРНК, например сплайсинга пре-мРНК или их транспорта из ядра в цитоплазму.

С помощью аптамеров, специфичных в отношении 7,8-дигидро-8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина, который возникает при повреждении ДНК радикалами кислорода, удавалось обнаруживать в ДНК одну такую молекулу среди 10 обычных остатков дезоксигуанозина. Аналогичные аптамеры могут быть потенциально использованы для мониторинга мутагенных последствий окислительного стресса в эукариотических клетках.

Перспективы использования аптамеров. Новейшие результаты, полученные с использованием аптамеров, указывают на возможность их применения в ближайшем будущем в биотехнологии для регулируемой экспрессии генов, а также для диагностики и терапии. Одним из наиболее интересных достижений в этой области исследований является создание рибозимов с аллостерическими свойствами. В таких конструкциях каталитический домен рибозима соединяют с последовательностями аптамеров-рецепторов, взаимодействующих с регуляторными молекулами. В присутствии низкомолекулярных регуляторов может происходить специфическая активация или ингибирование ферментативной активности рибозима. Такие гибридные конструкции получили название аптазимов. Недавно полученный аптазим, обладающий РНК-лигазной активностью, активировался в 105 раз в присутствии специфических низкомолекулярных эффекторов. При аналогичном подходе были сконструированы ATP-зависимые рибозимы.

Исключительно важные результаты могут быть получены при скрининге in vitro аптамеров среди пула фрагментов природных РНК. В этом случае библиотеки природных последовательностей могут быть использованы для поиска доменов нуклеиновых кислот, специфически взаимодействующих с известными молекулами биогенного происхождения, например белками ретровирусов, для которых неизвестны РНК-мишени клетки-хозяина. Не исключено, что в ходе такого рода исследований у РНК или их фрагментов будут обнаружены новые внутриклеточные функции, связанные с метаболизмом важных биологических кофакторов, включая ATP, GTP, FAD и NAD+.

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]