- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Адаптивные мутации
Проблема, связанная с возможностью возникновения адаптивных мутаций, имеет глубокие корни в биологии. За 50 лет до того как Ч. Дарвин начал свои знаменитые исследования происхождения биологических видов, другой биолог, француз Ж.Б. Ламарк, разработал учение о возможности наследования признаков, которые родительские организмы приобретали на протяжении жизни под действием окружающей среды. В терминах современной генетики это означает, что организм в ответ на определенное воздействие внешних факторов может целенаправленно изменять свой геном в клетках зародышевой линии таким образом, что он у потомков будет контролировать развитие признаков, максимально адаптированных к изменившимся внешним условиям. Следовательно, по Ламарку организм самостоятельно способен делать выбор между полезными и вредными признаками и тем самым направлять свои эволюционные преобразования. Поскольку любое наследуемое изменение генома представляет собой мутацию, неоламаркистские концепции предполагают, что организм может контролировать мутационные изменения своего генома и направлять их в нужное русло развития признаков, полезных для выживания.
Взгляды неодарвинистов на мутационный процесс прямо противоположны. В соответствии с их доктриной, доминирующей в системе взглядов современных молекулярных генетиков, мутации являются случайными и спонтанными событиями, а образующиеся мутантные признаки подвержены жесткому давлению естественного отбора. В популяциях закрепляются лишь мутации (и признаки), максимально соответствующие условиям окружающей среды. Остальные элиминируются в результате гибели мутантных особей.
Считается, что спор между неоламаркистами и неодарвинистами окончательно решен в пользу последних, по крайней мере, тремя классическими экспериментами. Во флуктуационном тесте (С. Лурия, М. Дельбрюк, 1943 г.) исследовали возникновение мутантов E. coli, устойчивых к бактериофагу Т1 в независимо выращиваемых культурах бактерий. Бактериальные клетки из разных пробирок высевали на чашки Петри с избытком фага Т1 и подсчитывали число образующихся бактериальных колоний, устойчивых к бактериофагу. Предполагалось, что если мутантные бактерии образуются в пробирках до вступления в контакт с бактериофагом, то количество устойчивых бактерий будет сильно различаться в разных пробирках в зависимости от числа делений, которые совершит мутантная бактерия с момента возникновения мутации до высева на чашку Петри. В том случае, когда мутации возникают после взаимодействия бактерий с вирусом, количество мутантных бактерий, обнаруживаемых на разных чашках, будут следовать непрерывному распределению Пуассона. В ходе этих экспериментов продемонстрировано предсуществование мутантных бактерий в культурах. В еще более наглядных опытах Дж. Ледерберга и Е.М. Ледерберг (1950 г.) с помощью бархатного штампа перепечатывали бактерии с газона на разные чашки Петри, содержащие бактериофаг Т1. Оказалось, что мутантные бактерии, устойчивые к бактериофагу, образуют колонии в одних и тех же местах разных чашек. Эти данные были также в пользу предсуществования мутантных бактерий в газоне, не имевшем контакта с бактериофагом. Однако в своих первых опытах исследователи имели дело с потомками исходных бактериальных клеток, которые контактировали с селектирующим агентом (бактериофагом Т1) в момент отбора. Поэтому "окончательное" решение вопроса было достигнуто после получения в 1956 г. штаммов бактерий, устойчивых к стрептомицину и ранее не соприкасавшихся с антибиотиком.
Потрясение твердо устоявшихся основ молекулярной генетики с неоламаркистских позиций началось в 1988 г. после опубликования в журнале "Nature" статьи Дж. Кэрнса, Дж. Овербаха и С. Миллера "Происхождение мутантов". В серии экспериментов с мутантными клетками E. coli, неспособными использовать лактозу в качестве источника углерода (фенотип Lac-), авторы установили, что скорость образования ревертантов в том случае, если мутантные бактерии инкубировали на чашках в присутствии лактозы, значительно превышала ожидаемую из случайного возникновения обратных мутаций в стационарной бактериальной культуре. На этом основании авторы сделали вывод о том, что селективные условия (присутствие неусваиваемой лактозы в качестве единственного источника углерода) оказывают влияние на спектр мутаций, возникающих у бактериальных клеток. В работе утверждается, что бактериальные клетки могут сами контролировать свой мутационный процесс, направляя его в сторону образования нужных мутантных ферментов, что позволяет клеткам адекватно реагировать на сигналы окружающей среды, которая направленно формирует генотип бактериальных клеток.
Такие "еретические" выводы Кэрнса и его соавторов получили экспериментальное подтверждение в его дальнейших исследованиях, а также в многочисленных работах других авторов с использованием бактериальных и дрожжевых клеток в качестве объекта. И хотя в ряде случаев было показано наличие артефактов, приводивших к неправильной интерпретации результатов, в целом существование феномена направленного образования адаптивных мутаций подтверждено и пока не опровергнуто. Однако он может занять достойное место среди других хорошо доказанных генетических явлений лишь после экспериментального выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе адаптивных мутаций.
Для объяснения этих фактов в настоящее время выдвинуто несколько гипотез, ни одна из которых пока не получила полного экспериментального подтверждения. По мнению Кэрнса и соавторов (1988 г.) клетки синтезируют набор вариабельных, незначительно различающихся по первичной структуре молекул мРНК, и путем обратной транскрипции получают копию кДНК с одной из них, кодирующей наиболее подходящую для адаптации белковую молекулу. Далее такая кДНК в результате рекомбинации замещает мутантный аллель в геноме микроорганизма. Б.Д. Дэвис (1989 г.) считает, что индукция транскрипции отдельных локусов в геноме покоящихся микроорганизмов, в частности лактозой, повышает их мутабильность. Ф.У. Сталь (1988 г.) и Л. Боэ (1990 г.) высказывают предположение о снижении функционирования систем репарации ДНК у голодающих микроорганизмов, что может быть причиной повышения частоты мутаций в транскрибируемых локусах. Те же авторы предполагают, что в основе феномена направленного повышения частоты мутаций лежит recA-зависимая амплификация соответствующих генетических локусов, сопровождаемая корректирующим мутагенезом. Б.Г. Холл (1990 г.) для объяснения адаптивных мутаций разработал модель, в соответствии с которой в популяции голодающих микроорганизмов часть клеток находится в состоянии повышенной мутабильности. Среди этих клеток выживают лишь мутанты, максимально соответствующие требованиям окружающей среды.
По крайней мере, два результата исследований последних лет делают концепцию Холла наиболее приемлемой. Прежде всего было установлено, что реверсия мутантных бактериальных клеток к фенотипу Lac+ в условиях голодания требует функционирования RecBCD-зависимой репарационной системы рекомбинации (см. раздел 5.2.3). Кроме того, в бактериальном геноме были обнаружены горячие и холодные точки, в которых образование адаптивных мутаций может происходить соответственно с высокой и низкой частотой, что объясняет отмеченную в литературе невозможность их обнаружения в некоторых генетических локусах. Поскольку на первых этапах работы репарационной системы рекомбинации происходит внесение в ДНК двухцепочечных разрывов, с которыми далее взаимодействует комплекс белков RecBCD, полагают, что такие разрывы ДНК инициируют процесс возникновения адаптивных мутаций.
Во время рекомбинационного обмена цепями ДНК, индуцированного двухцепочечными разрывами, происходит синтез новых цепей ДНК-полимеразой III, сопровождаемый ошибочным включением нуклеотидов. (Как уже упоминалось в разделе 5.1.2, ДНК-полимераза III является активным участником SOS-мутагенеза у бактерий.) Такие ошибочно включенные нуклеотиды с высокой вероятностью могут закрепляться в геноме в виде мутаций из-за ослабления эффективности функционирования системы эксцизионной репарации у бактериальных клеток, находящихся в стационарной фазе роста, и, следовательно, формирования у голодающих бактериальных клеток мутаторного фенотипа. При случайном возникновении мутации, возвращающей клетку к нормальному Lac+-фенотипу, мутантная бактерия выходит из стационарной фазы и начинает активно делиться. При этом происходит восстановление обычного функционирования системы репарации.
Как можно видеть, обсуждаемая модель не оставляет места классическому неоламаркизму. При реализации такого механизма возникновение "адаптивной" мутации определяет случай, и после ее появления происходит клональное замещение исходной популяции бактерий мутантными клетками. Однако выбор самих генетических локусов, в которых могут происходить такие мутации, уже не является случайным. Он генетически детерминирован, на мой взгляд, структурой бактериального генома. В соответствии с развиваемой в разделе 5.3 концепцией альтруистичной ДНК, адаптивные мутации являются в конечном итоге естественным следствием дифференциальной защиты отдельных генетических локусов от спонтанных мутаций, определяемой пространственной структурой ДНК локусов. Как будет следовать из дальнейшего изложения, частота мутаций в первом приближении обратно пропорциональна уровню конденсации ДНК конкретного генетического локуса и определяется физической доступностью отдельных его частей химическим мутагенам и(или) ферментам системы репарации. Кроме того, индукция транскрипции этих предетерминированных локусов или даже простое удаление регуляторных белков из промоторной зоны генов могли бы изменять их пространственную структуру и, как следствие, уровень мутабильности соответствующих участков генома.