Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
gene_expression.doc
Скачиваний:
632
Добавлен:
13.03.2016
Размер:
6.12 Mб
Скачать

Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber

Фермент

Источник

Ген

Субстрат (см. рис. I.57)

Урацил-ДНК-гликозилаза

E. coli

S. cerevisiae

Человек

ung

UNG

UDG

а

»

»

3-Метиладенин-ДНК-гликозилаза

E. coli

»

S. cerevisiae

Человек

tag

alkA

MAG

MPG

к

з, к–м, (б, и)

б, к, л

к, (д)

Fapy/8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза

(fapy – формамидопиримидин)

E. coli

S. cerevisiae

Человек

fpg/mutM

?

?

в–д

г и/или д

»

Эндонуклеаза III/тимингликоль-ДНК-гликозилаза

E. coli

nth

в, е, ж

Эндонуклеаза VIII

E. coli

nei

»

A-G-ДНК-гликозилаза

»

Человек

mutY

?

Аденин/в

»

G-T-ДНК-гликозилаза

»

?

G-T, (U-G)

УФ-эндонуклеаза

T4

M. luteus

?

?

Пиримидиновые димеры

То же

Гидроксиметилурацил-ДНК-гликозилаза

Человек

?

з

Формилурацил-ДНК-гликозилаза

»

?

Ж

Примечание. В скобках приведены предположительные субстраты.

Рис. I.57. Модифицированные азотистые основания ДНК, удаляемые ДНК–гликозилазами при функционировании BER

а– урацил;б– гипоксантин;в– 5–гидроксицитозин;г– 2,5-диамино-4-формамидопиримидин;д– 7,8-дигидро-8-оксогуанин;е– мочевина;ж– тимингликоль;з– 5-формилурацил;и– 5-гидроксиметилурацил;к– 3-метиладенин;л– 7-метилгуанин;м– 2-метилцитозин

АР-дезоксирибоза (apurinic/apyrimidinic deoxyribose), образовавшаяся в результате удаления модифицированного азотистого основания апуринового/апиримидинового (AP-) сайта, далее вырезается с помощью АР-лиазы, которая освобождает ее 3’-конец, и АР-эндонуклеазы, гидролизующей ее 5’-концевую фосфодиэфирную связь в АР-сайте (см. рис. I.58). Однонуклеотидная брешь затем заполняется с помощью ДНК-полимеразы, и фосфодиэфирная связь восстанавливается в реакции лигирования. У E. coli репаративный синтез ДНК выполняет ДНК-полимераза I, у дрожжей – ДНК-полимераза . Из трех ДНК-лигаз, которыми обладают клетки животных, в BER, по-видимому, участвует ДНК-лигаза III.

Рис. I.58. Основные пути и этапы эксцизионной репарации у животных

Цифрами обозначены последовательные этапы функционирования BER и NER

В последнее время начаты исследования механизмов сопряжения BER с другими генетическими процессами, протекающими внутри клеток: транскрипцией, репликацией ДНК и регуляцией клеточного цикла. Для соматических клеток менее опасно иметь повреждения ДНК, связанные с появлением некодирующих (AP-) участков, чем ошибочно кодирующих оснований, поскольку последние приводят к образованию мутаций, тогда как первые допускают осуществление полноценной пострепликативной репарации повреждений. ДНК-гликозилазы, участвующие в BER, способны переводить сайты, содержащие модифицированные основания (например урацил), в некодирующие сегменты одной из цепей ДНК. Урацилгликозилазы, ассоциированные с белковыми комплексами репликативных вилок, действуют очень эффективно на одноцепочечные ДНК, и их активность регулируется во время клеточного цикла.

Эксцизионная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов (NER). Если в системе BER происходит удаление отдельных поврежденных азотистых оснований ДНК путем разрыва соответствующих N-гликозидных связей между азотистыми основаниями и остатками дезоксирибозы, то в системе NER поврежденные азотистые основания вырезаются в составе олигонуклеотидов. NER может осуществляться двумя путями. В первом случае происходит гидролиз фосфодиэфирной связи по 3’- или 5’-концу на некотором расстоянии от ошибочно спаренного (поврежденного) нуклеотида, который далее целиком удаляется под действием 5’3’- (или 3’5’-) экзонуклеазы, гидролизующей цепь ДНК нуклеотид за нуклеотидом в соответствующем направлении от первоначального одноцепочечного разрыва в репарируемой ДНК. Образующаяся брешь далее заполняется ДНК-полимеразой. Такой механизм репарации реализуется у E. coli и человека для вырезания неповрежденных (немодифицированных) ошибочно спаренных нуклеотидов. Механизм последовательного эндо- и экзонуклеазного расщепления ДНК не используется для удаления поврежденных (измененных) нуклеотидов. Это связано, по-видимому, с тем, что такие нуклеотиды (например возникшие в результате образования аддуктов с мутагенами) часто являются ингибиторами экзонуклеаз.

Одним из решений данной проблемы представляется использование ферментной системы, которая вносила бы одноцепочечные разрывы по обе стороны от поврежденного нуклеотида на некотором расстоянии от него с последующим удалением одноцепочечного фрагмента ДНК, содержащего измененный нуклеотид. Действительно, такой второй механизм эксцизионной репарации функционирует у всех исследованных видов живых организмов и будет рассмотрен ниже более подробно.

В универсальном механизме эксцизионной репарации как прокариоты, так и эукариоты гидролизуют 3–5-ю фосфодиэфирную связь с 3'-конца от повреждения (см. рис. I.56). При этом прокариоты гидролизуют также 8-ю связь от 5’-конца измененного нуклеотида, тогда как у эукариотических организмов происходит одноцепочечный разрыв на расстоянии 21–25 нуклеотидов от повреждения со стороны его 5’-конца. Таким образом, прокариоты удаляют измененный нуклеотид в составе 12–13-членных олигомеров, тогда как эукариоты – в составе одноцепочечных фрагментов ДНК длиной в 27–29 нуклеотидов. Ферментная система, вносящая такие двойные одноцепочечные разрывы, получила название эксцизионной нуклеазы (эксцинуклеазы). Образующаяся в молекуле репарируемой ДНК одноцепочечная брешь далее заполняется с помощью ДНК-полимеразы, а фосфодиэфирная связь в остающемся одноцепочечном разрыве восстанавливается ДНК-лигазой.

Генетика NER. Гены NER E. coli uvrA, uvrB и uvrC не обнаруживают гомологии с соответствующими генами человека. В отличие от них гены NER дрожжей и человека высокогомологичны, и энзимология эксцизионной репарации в этих двух системах также обладает большим сходством. По крайней мере, три заболевания у человека вызываются генетическими нарушениями системы эксцизионной репарации: пигментная ксеродерма, синдром Кокейна и трихотиодистрофия.

Кожа больных пигментной ксеродермой обладает повышенной чувствительностью к дневному свету, что проявляется в виде фотодерматозов, включая рак кожи. В ряде случаев отмечены аномалии нервной системы, причиной которых являются мутации в одном из семи генов: XPA, XPB, ...XPG. Однако описаны больные с классическими симптомами пигментной ксеродермы, но с ненарушенной системой NER. Для клеток этих больных характерны изменения в так называемой пострепликативной репарации. Больным с синдромом Кокейна присущи нарушения роста, умственная отсталость, катаракты, повышенная чувствительность к свету с сопутствующими дерматозами. Обнаружены мутации в двух группах генов, приводящие к этому заболеванию. У больных с мутантными генами CS-A или CS-B клетки способны нормально репарировать УФ-повреждения ДНК. У другой группы больных обнаружены мутации в генах XPB, XPD или XPG. У больных трихотиодистрофией со смешанными симптомами выявлены мутации в генах XPB или XPD. Классические симптомы этого заболевания, по-видимому, являются следствием мутации в гене транскрипционного фактора TFIIH.

Получение мутантов с измененной NER у грызунов позволило разбить такие гены на 11 групп комплементации, большинство из которых соответствует группам комплементации XP и CS человека. Часть соответствующих генов человека удалось клонировать, используя их способность исправлять (комплементировать) генетические дефекты в культивируемых мутантных клетках грызунов. Эти гены получили название кросс-комплементирующих генов эксцизионной репарации (ERCC – excision repair cross complementing). Среди них гены XPE и ERCC6ERCC11 не требовались для прохождения основных реакций эксцизионной репарации, и их функция неизвестна.

Структура и функции белков NER. В табл. I.21 суммированы некоторые свойства белков животных, участвующих в NER. Большинство таких белков существует in vivo в виде комплексов, поэтому необходимо иметь в виду, что ферментативные активности, обнаруживаемые у отдельных

Таблица I.21

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]