- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Молекулы рнк у истоков жизни
Большинство современных теорий происхождения жизни рассматривает молекулы РНК, обладающие активностями рибозимов, в качестве первичных самореплицирующихся молекул, давших начало развитию жизни на Земле. Результаты исследования двух гипотетических групп рибозимов лежат в основе современных представлений о происхождении жизни. Прежде всего, это РНК-репликазы, построенные исключительно из рибонуклеотидов, т.е. молекулы РНК, способные самореплицироваться. Такое предположение кажется особенно привлекательным, поскольку древние молекулы РНК, с одной стороны, могли бы хранить генетическую информацию, а с другой – обладать ферментативной активностью, необходимой для воспроизведения этой информации. Подобное сочетание свойств в молекуле РНК позволяет объяснить, каким образом каталитические функции, выполняемые современными белковыми молекулами, а также функции хранения и передачи генетической информации возникли одновременно и могли присутствовать в одной молекуле-предшественнике прародителей современных клеток. При переходе от первоначального мира самореплицирующихся молекул РНК к современному живому миру, повсеместно использующему белковый катализ, предполагают возникновение молекул рибозимов, способных осуществлять синтез белка из абиотически возникших его предшественников – аминокислот.
Теории происхождения жизни, основанные на первоначальном участии молекул РНК в создании самореплицирующихся и самоусложняющихся систем, нашли прочную поддержку в связи с открытием аутосплайсинга и рибозимов. Как будет видно из дальнейшего изложения, механизм аутосплайсинга не сильно отличается от комплекса химических реакций, необходимых для репликации нуклеиновых кислот. Кроме того, в настоящее время все больше утверждается точка зрения, в соответствии с которой именно современные рибосомные РНК составляют каталитическую сердцевину рибосомы и могут быть потомками рибозимов, самостоятельно осуществлявших синтез полипептидов. В этой связи представляют интерес некоторые гипотетические схемы молекулярных механизмов экспрессии предшественников современных генов.
Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
Для первоначального появления рибозимов необходим абиотический синтез олигорибонуклеотидов длиной 30–70 оснований. Долгое время это требование было камнем преткновения в разработке теории происхождения жизни, основанной на РНК. Недавно было показано, что после спонтанной иммобилизации на твердой поверхности коротких олигонуклеотидов в присутствии свежих порций активированных мономеров их длина может самопроизвольно удлиняться до 55 остатков. Значительным осложнением для обоснования теории было также то, что мономеры в спонтанно образующихся олигонуклеотидах соединены друг с другом смешанными 2’–5’- и 3’–5’-связями. Такая гетерогенность олигонуклеотидов должна затруднять их последующую матричную активность. Оказалось, однако, что олигоцитидилаты, содержащие смешанные связи, могут служить матрицами для спонтанной полимеризации мономеров, активированных имидазолом, с образованием олигогуанилатов. Таким образом, вышеупомянутые возражения в настоящее время едва ли существенны для обсуждаемой теории.
Для того чтобы репликация РНК самими молекулами РНК имела место, необходимо одновременное присутствие в одном микрообъеме, по крайней мере, двух молекул рибозима-репликазы или же репликазы и комплементарной ей цепи РНК, которая служила бы матрицей для репликазы. В таком случае цикл воспроизводства молекулы репликазы можно представить следующим образом. После разделения цепей синтезированной репликазы и матрицы с последней соединяется олигонуклеотидный праймер, который последовательно удлиняется рибозимом-репликазой, образовавшейся в результате фолдинга второй цепи. Предполагается, что неорганические поверхности, обладающие большим сродством к одноцепочечным РНК, способствуют разделению цепей после завершения акта репликации. При этом должна существовать определенная компартментализация таких молекул (например обеспечиваемая силами адсорбции), препятствующая слишком далекому расхождению разделившихся цепей РНК. И, наконец, синтез РНК, осуществляемый древней репликазой, должен характеризоваться определенным уровнем точности.
Выше уже были рассмотрены механизмы реакций аутосплайсинга и транс-сплайсинга, осуществляемые рибозимами интронов группы I Tetrahymena. В основе этих процессов лежит основанная на переэтерификации аутокаталитическая реакция объединения (лигирования) двух полирибонуклеотидных последовательностей (экзонов), сопровождающаяся удлинением акцепторной последовательности, которое можно рассматривать как прототип реакции полимеризации. В настоящее время экспериментально подтверждена возможность участия в таких реакциях более коротких олигонуклеотидов. В частности, благодаря этим реакциям пентамеры цитидиловой кислоты (С5) превращались в гетерогенную популяцию олиго(С), содержащую даже 30-членные олигонуклеотиды. Вскоре было показано, что и динуклеотиды GpC могут выступать в качестве доноров мононуклеотидов при элонгации С5 с образованием С10 в реакции удлинения праймера (C5 + 5GpC C10 + 5G). Частота ошибок в такой реакции в условиях насыщения GpC-субстратами составляла ~35% и была слишком большой для того чтобы обеспечивать саморепликацию молекул РНК.
Альтернативой реакции удлинения праймера на один нуклеотид за цикл может быть зависимая от матрицы реакция элонгации праймера олигонуклеотидами, которая также была продемонстрирована экспериментально. Здесь донорами выступали триплеты олигорибонуклеотидов и, как уже упоминалось выше, крайним известным случаем такой реакции является объединение экзонов. При этом рибозимы Tetrahymena в качестве матриц для сборки олигонуклеотидов могут использовать различные внутренние последовательности нуклеотидов. Так, олигонуклеотиды длиной 8–12 остатков недавно были применены для сборки полной цепи, комплементарной последовательности самого рибозима.
Низкий выход продуктов полной длины в экспериментах, упомянутых выше, позволял предполагать, что с этой задачей успешнее могли бы справиться более короткие и активные рибозимы, которые пока еще в природе неизвестны. В связи с этим была разработана система отбора in vitro, позволившая повысить эффективность реакции лигирования путем получения более коротких производных известного рибозима sunY. Приблизительно 21013 вариантов нуклеотидных последовательностей рибозима в виде единого пула были подвергнуты нескольким циклам все более строгого отбора вариантов рибозима на повышенную способность к лигированию с последующей амплификацией последовательностей в конце каждого цикла отбора. Такие варианты рибозимов с более короткой полинуклеотидной цепью вскоре были получены. Они обладали способностью эффективно осуществлять из 18 олигонуклеотидов полную сборку цепи РНК, комплементарной своей собственной полинуклеотидной цепи. Наиболее интересной находкой в ходе такого рода экспериментов по отбору из пула случайных последовательностей оказался рибозим длиной в 100 нуклеотидов, получивший название лигазы класса I. Этот рибозим осуществлял образование 3’–5’-фосфодиэфирных связей, и его эффективность была сопоставима с таковой фермента – природной ДНК-лигазы (kкат >1 с-1). Недавно было продемонстрировано, что лигаза класса I может выполнять функции РНК-полимеразы, осуществляя элонгацию праймера путем использования рибонуклеозидтрифосфатов в качестве субстратов. Основным ограничением этой реакции является то, что поскольку комплекс рибозим–матрица удерживается комплементарными взаимодействиями, элонгация праймера прекращается, как только 3’-конец образующегося продукта достигает конца матрицы. В реакции не только используются все четыре рибонуклеозидтрифосфата, но и достигается большая точность синтеза РНК (92%). Дальнейшее ее повышение хотя бы в 10 раз позволило бы этой искусственной РНК-полимеразе воспроизводить свою собственную последовательность нуклеотидов. Полагают, что полное превращение рибозима в РНК-полимеразу произойдет после того, как матрица будет связываться с ним некомплементарными взаимодействиями.
Условия отбора, использованные для получения эволюционирующих in vitro молекул лигазы класса I, были отработаны на современных субстратах (рибонуклеозидтрифосфатах). Не исключено, что изменение этих условий позволит получить рибозимы с новыми активностями. Недавно был описан рибозим, осуществляющий реакцию, аналогичную кэпированию акцепторного олигонуклеотида, которая завершалась присоединением к его 5’-концу молекулы аденозинмонофосфата посредством 5’–5’-фосфодиэфирной связи. Полагают, что, используя в качестве субстратов высокоактивированные рибонуклеозидмонофосфаты, можно будет получить рибозимы, непосредственно полимеризующие мононуклеотиды.