4. Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)

Получение временной экспрессии генов в клетках COS часто используется для быстрой наработки рекомбинантных белков и ДНК. При конструировании клеток COS клетки зеленой мартышки CV-1 были трансформированы вирусом SV40 с дефектной областью начала репликации. В результате были получены три линии клеток (COS-1, 2 и 7), конститутивно экспрессирующих большой T-антиген вируса. После проведения трансфекции клеток экспрессирующими плазмидами, содержащими область начала репликации вируса SV40, последняя эффективно взаимодействует с эндогенным T-антигеном, что сопровождается внехромосомной репликацией плазмиды с образованием большого числа ее копий в цитоплазме клеток. Если рекомбинантный ген в такой плазмиде находится под контролем подходящего промотора, то это приводит к внутриклеточному образованию рекомбинантных белков в больших количествах.

Число копий плазмид, введенных в клетки COS, достигает максимума через ~48 ч после трансфекции. Далее внутриклеточный уровень плазмидной ДНК начинает постепенно снижаться из-за ее цитопатического действия и гибели клеток. В результате системы, основанные на клетках COS, не могут быть использованы для крупномасштабной наработки рекомбинантных белков в течение длительного промежутка времени. Максимальное внутриклеточное содержание рекомбинантных белков в этих системах наблюдают через 72 ч после трансфекции, и их синтез продолжается в течение последующих 5–10 дней на фоне медленного снижения количества клеток в культуре, что позволяет все же использовать клетки COS для препаративного синтеза рекомбинантных белков. С этой целью трансфекции одновременно подвергают до 10⁸ клеток с последующим их выращиванием на роллерах или микроносителях, сопровождаемым многократным сбором культуральной жидкости. Такой подход позволяет получать до нескольких миллиграммов рекомбинантного белка из вышеописанного пула трансфецированных клеток.

Эффективность системы экспрессии, основанной на клетках COS, зависит, в первую очередь, от природы рекомбинантного белка, которая определяет его чувствительность к внутриклеточным протеиназам, а также метода трансфекции, соотношения числа клеток и молекул рекомбинантных плазмид, используемых для трансфекции, и состава питательной среды. Пример экспрессирующей кассеты генов, используемой в этой системе, представлен на рис. II.13,а. Такой фрагмент ДНК может быть интегрирован в подходящую коммерческую плазмиду, в частности в экспрессирующий вектор pXMT3.

5. Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами

Многочисленное семейство бакуловирусов, размножающихся в клетках беспозвоночных, обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80–220 т.п.о. Круг хозяев бакуловирусов ограничен главным образом членистоногими. Клетки млекопитающих могут быть заражены бакуловирусами только при высокой множественности инфекции. При этом вирус проникает в клетки, но в них не воспроизводится, не экспрессирует рекомбинантные гены с промоторов насекомых и не способен находиться (персистировать) в клетках животных длительное время.

Интерес к бакуловирусам как потенциальным переносчикам рекомбинантных генов и системам, обеспечивающим их экспрессию, стал возникать после того, как была обнаружена их способность к синтезу большого количества вирусных белков на поздних стадиях инфекции. В частности, это касается вирусных полиэдрина и белка p10, гены которых находятся под контролем сильных поздних промоторов и которые могут быть удалены без ущерба для размножения вирусов. Поэтому замещение указанных генов рекомбинантными сопровождается усиленной экспрессией последних.

Первоначально использование бакуловирусов с культурами клеток вызывало большие затруднения из-за экзотичности объекта исследования. Однако с ростом интереса к этим системам экспрессии были разработаны многочисленные варианты рекомбинантных вирусов и векторов на их основе, включая челночные векторы для клеток дрожжей и бактерий. Кроме того, успех этой системы связан с получением удобных линий клеток насекомых. В настоящее время наиболее часто используемыми клеточными линиями остаются IPLB-Sf-21-AE (получена из Spodoptera frugiperda), ее клональная производная Sf9, а также BTI-TN-5B1–4 и TN368 из Trichopsula ni. Современные клеточные линии насекомых выращивают в виде суспензионных культур на роллерах и в ферментерах на питательных средах, не содержащих фетальной сыворотки.

Для проявления в полной мере биологической активности многих рекомбинантных белков требуются посттрансляционные модификации их полипептидных цепей. Оказалось, что клетки насекомых обладают способностью производить большое число таких модификаций, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование остатками жирных кислот и амидирование. Рекомбинантные белки могут претерпевать в них адекватный протеолитический процессинг путем удаления сигнальных последовательностей аминокислот и переноситься в соответствующие клеточные компартменты. Были проведены интенсивные исследования механизмов N-гликозилирования в клетках насекомых, которые показали, что хотя оно и происходит, но не соответствует в полной мере таковому клеток млекопитающих.