3. S1-картирование рнк и днк

Нуклеаза S1, специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК, успешно используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой ей РНК, точного картирования мест инициации и терминации транскрипции на ДНК-матрицах, а также для оценки гомологии между двумя молекулами ДНК или РНК. Для обнаружения интронов в изучаемых генах клонированный в составе геномной ДНК ген гибридизуют со зрелой РНК, кодируемой этим геном. При наличии в гене интронов их последовательности в ДНК-РНК-гибридах освобождаются в виде одноцепочечных участков и могут быть специфически гидролизованы S1-нуклеазой. При электрофоретическом разделении продуктов гидролиза в денатурирующих условиях при наличии интронов наблюдают появление фрагментов ДНК, причем на основании размеров фрагментов можно локализовать положение интронов в гене. Такой же подход используется и для анализа гомологии между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или обнаружения мутаций.

Использование S1-нуклеазы позволяет с точностью до одного–двух нуклеотидов картировать положение точек инициации и терминации транскрипции внутри гена. И в этом случае короткие меченые фрагменты 5’- или 3’-концевых частей гена, заключающие в себе указанные последовательности ДНК, гибридизуют с исследуемыми РНК и образовавшиеся ДНК-РНК-гибриды инкубируют с S1-нуклеазой. Электрофоретическая подвижность полученного фрагмента ДНК, защищенного от действия S1-нуклеазы концевой частью анализируемой РНК, сравнивается с таковой фрагментов того же участка ДНК, образующихся при его секвенировании по методу Максама-Гилберта. В результате однозначно определяют положение нуклеотидов во фрагментах исследуемых ДНК, которые защищены в ДНК-РНК-гибридах от действия S1-нуклеазы.

4. Футпринтинг

Принцип защиты последовательности нуклеотидов рестрикционных фрагментов ДНК белками от действия агентов, расщепляющих ДНК, лежит в основе футпринтинга – метода, позволяющего определять места специфических контактов белков с ДНК. Этот метод оказался особенно полезным для точной локализации последовательностей нуклеотидов генов, взаимодействующих с регуляторными белками, активаторами и репрессорами, а также с самими РНК-полимеразами, и своему появлению целиком обязан генной инженерии. Рестрикционные фрагменты ДНК, последовательности нуклеотидов которых известны, метят по одному из концов ³²P и инкубируют с исследуемыми белками. Образовавшиеся комплексы белок–ДНК подвергают действию агентов, гидролизующих ДНК, например ДНКазы I, в условиях неполного расщепления ДНК, и полученные продукты гидролиза разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей авторадиографией. В отсутствие белка на авторадиограммах наблюдают появление полного набора фрагментов ДНК в том виде, как это имеет место при обычном секвенировании ДНК. Участки ДНК, защищенные белком от действия ДНКазы, идентифицируются по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления ДНК, концы которых попадают в область связывания с белком. При этом на электрофоретических дорожках появляются характерные пропуски (или "следы" – footprints), что и дало название всему методу.