- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
Как будет видно из дальнейшего изложения, инициация трансляции эукариотических мРНК может осуществляться, по крайней мере, тремя способами. В соответствии с первым наиболее распространенным механизмом (модель сканирования) рибосомы после взаимодействия с 5'-концевой последовательностью мРНК осуществляют поиск инициирующего AUG-кодона, перемещаясь вдоль 5'UTR. При реализации второго механизма рибосомы инициируют биосинтез белка навнутреннихAUG-кодонах, удаленных от 5'-концевой кэп-группы. И, наконец, после освобождения полипептида из транслирующего комплекса рибосомы, не отделяясь от мРНК, способныреинициироватьбиосинтез белка на следующем инициирующем кодоне.
Факторы инициации трансляции.Большинство молекулярных механизмов, осуществляющих регуляцию экспрессии генов на уровне трансляции, реализуется на стадии инициации биосинтеза белка. По-видимому, этот факт находит свое отражение в большой сложности аппарата инициации трансляции. Помимо субъединиц эукариотических рибосом и белков, обычно ассоциированных с 5'- и 3'-концевыми последовательностями мРНК, в инициации принимают участие по меньшей мере 11 белковых факторов, построенных более чем из 25 полипептидов (табл.I.11).
Таблица I.11
Факторы инициации трансляции дрожжей S. cerevisiae
Фактор |
Субъединица |
Предполагаемая функция |
eIF1 |
|
Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей рибосом и распознавание инициирующего AUG-кодона (у животных) |
eIF1A |
|
Обеспечивает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом, связывание Met-тРНК и распознавание инициирующего кодона (у животных) |
eIF2 |
α, β, γ |
Участвует в выборе инициирующего кодона |
eIF2B |
α, β, γ, δ, ε |
Обеспечивает обмен гуанилового нуклеотида на eIF2 |
eIF3 |
α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ |
Обеспечивает связывание Met-тРНК и мРНК с 40S субчастицей и диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом |
eIF4A |
|
АТРаза, РНК-связывающая хеликаза |
eIF4B |
|
Хеликаза, облегчающая связывание РНК |
eIF4E |
|
Взаимодействует с кэп-группой мРНК |
eIF4G |
G1(p150), G2(p130) |
Взаимодействует с eIF3, eIF4E и Pab 1p |
eIF4H |
|
Стимулирует активность eIF4B и компонентов eIF4F |
eIF5 |
|
Вызывает диссоциацию факторов инициации |
eIF5A |
|
Функции неизвестны, мутации изменяют стабильность мРНК |
eIF6 |
|
Вызывает диссоциацию 40S–60S субчастиц рибосом |
Учитывая сложность процесса инициации трансляции у эукариот, последовательность реакций, приводящих к образованию первой пептидной связи в строящемся полипептиде, удобно разбить на ряд последовательных этапов, что является сознательным упрощением единого процесса.
Взаимодействие мРНК с кэп-связывающим комплексом и рибосомами. Возможность вступления эукариотических мРНК в цикл трансляции как правило обеспечивается их 5'-концевыми кэп-структурами, с которыми взаимодействуют белки кэп-связывающего комплекса (CBC). Хотя основными компонентамиCBCявляются факторы инициации трансляции, его роль далеко не ограничивается участием в инициации синтеза белка рибосомами. Как уже обсуждалось в разделе 2.2.4, полифункциональные белкиCBCинтегрируют основные реакции метаболизма мРНК и их предшественников в эукариотических клетках, необходимые для осуществления эффективной регулируемой трансляции.
Взаимодействие eIF2 с Met-тРНК. Гетеротримерный фактор eIF2 обеспечивает взаимодействие рибосом с инициаторной Met-тРНК и мРНК in vitro. Гены всех трех субъединиц являются жизненно важными. В связанном с GTP состоянии eIF2 приобретает способность взаимодействовать с Met-тРНК с образованием тройного комплекса Met-тРНК–eIF2–GTP. Имеются данные, указывающие на участие фактора eIF2B в обмене GDP на GTP в комплексе eIF2–GDP. Неизвестна точная последовательность объединения тройного комплекса с рибосомой и мРНК. Большая часть имеющихся данных указывает на то, что взаимодействие тройного комплекса с 40S субчастицей рибосом предшествует образованию комплекса 40S-мРНК. Однако наличие феномена реинициации трансляции, при которой тройной комплекс входит в инициирующий комплекс с предсуществующим комплексом рибосома–мРНК, указывает на возможность осуществления этих событий в другой последовательности.
Формирование кэп-связывающего комплекса на мРНК.Сборка прединициационного комплекса на мРНК начинается со взаимодействия фактора eIF4E с кэп-группой мРНК. Это дает возможность объединения eIF4E и eIF4G с образованием многокомпонентного фактора eIF4F. В настоящее время не исключается возможность того, что объединение eIF4E и eIF4G предшествует взаимодействию первого с кэп-группой. У животных в состав многокомпонентного фактора eIF4F, кроме того, входит eIF4A, причем eIF4G удерживает два других фактора рядом друг с другом. Комплекс факторов eIF4F животных обладает двунаправленной ATP-зависимой РНК-хеликазной активностью, которая стимулируется фактором eIF4B. Недавно (1998 г.) обнаруженный фактор eIF4H усиливает активность eIF4F и eIF4B, однако его истинная роль в инициации трансляции остается невыясненной. Еще два белка дрожжей взаимодействуют с компонентами eIF4F: белок p20, конкурирующий с eIF4G за связывание eIF4E, а также поли(А)-связывающий белок Pab 1p, который контактирует со специфическим сайтом полипептидной цепи фактора eIF4G1. Функциональным аналогом p20 у млекопитающих является белок 4E-BP – ингибитор инициации трансляции.
Полипептидная цепь eIF4G млекопитающих содержит сайты связывания факторов eIF3, eIF4E и eIF4A. На этом основании делается вывод, что eIF4G в обоих системах выполняет функции белка-адаптера, обеспечивающего сборку комплекса eIF4F. Исключительно важная роль фактора eIF4E в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции (и в канцерогенезе) будет рассмотрена в разделе 3.4.1.
Таким образом, взаимодействию малой субчастицы рибосом с мРНК предшествует серия высоко специфических белок–белковых и белково–нуклеиновых взаимодействий, приводящих к формированию белкового комплекса вокруг кэп-группы мРНК, в котором полипептидная цепь фактора eIF4G обладает сайтом связывания eIF3. Последний, в свою очередь, специфически взаимодействует с малой субчастицей рибосом, обеспечивая ее вхождение в прединициационный комплекс. При этом 40S субчастица ассоциирована с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP, содержащим аминоацилированную инициаторную тРНКMet.
В итоге образуется прединициационный комплекс, содержащий мРНК, 40S субчастицу рибосом, связанную с тройным комплексом Met-тРНК–eIF2–GTP и через фактор eIF3 взаимодействующую с фактором eIF4G. Последний, в свою очередь, является частью многокомпонентного фактора eIF4F, в который кроме eIF4G входят eIF4E, взаимодействующий с кэп-группой мРНК, и eIF4A, обладающий РНК-хеликазной активностью. Кроме того, в состав этого комплекса входит фактор eIF1A. В таком виде прединициационный комплекс способен перемещаться вдоль 5'UTR мРНК и осуществлять поиск инициирующего AUG-кодона.
Роль 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в инициации трансляции.Помимо вышеупомянутых сайтов белок–белковых взаимодействий, N-концевая часть полипептидной цепи дрожжевого eIF4G содержит участок, взаимодействующий с поли(А)-связывающим белком Pab1p. Другим указанием на участие 3'-концевой поли(А)-последовательности мРНК в трансляции является наличие мутаций в генах рибосомных белков 60S субчастицы, супрессирующих мутации в генеpab1. Кроме того, как будет видно из дальнейшего изложения, 3'-концевая поли(А)-последовательность мРНК может обеспечивать кэп-независимую инициацию трансляции. Данные такого рода указывают на возможную ключевую роль этой последовательности в инициации синтеза белка, однако механизм данного явления остается неизвестным.
Выбор точки инициации трансляции и инициация биосинтеза белка.Сформировавшись, прединициационный комплекс должен оказаться на инициирующем AUG-кодоне мРНК, в ряде случаев весьма удаленном от кэп-группы, с которой он первоначально взаимодействует. Рибосомы прокариот локализуют точку инициации биосинтеза белка путем непосредственного взаимодействия регуляторных элементов 5'UTR их мРНК (таких, как SD-последовательность), расположенных в области инициации трансляции TIR (translationinitiationregion), с 3'-концевой последовательностью 16S рРНК малой субчастицы рибосом. В эукариотической клетке не обнаружено подобных взаимодействий между мРНК и рРНК. Одной из наиболее популярных в настоящее время моделей поиска эукариотической рибосомой точки инициации трансляции является модель сканирования, в соответствии с которой прединициационный комплекс перемещается вдоль 5'UTR до первого специфически распознаваемого им инициирующего кодона.
Модель сканирующей рибосомы.Как следует из модели сканирования, сформированный прединициационный комплекс перемещается от кэп-группы мРНК вдоль 5'UTR, "проверяя" ее последовательность на наличие инициирующего AUG-кодона. В настоящее время отсутствуют твердые доказательства того, что сканирование является строго однонаправленным. Из-за отсутствия в мРНК эукариот SD-подобных последовательностей и соответствующих контактов с рРНК AUG-кодон распознается в результате кодон–антикодонового взаимодействия с участием Met-тРНК, входящей в состав прединициационного комплекса. Перемещение комплекса часто должно происходить на фоне ярко выраженной вторичной структуры лидерной последовательности мРНК. В этой связи предполагается, что происходящее во время сканирования расщепление ATP сопряжено с работой РНК-хеликазы, разрушающей вторичную структуру 5'UTR. Как уже упоминалось, данная активность ассоциирована с фактором eIF4A, входящим в состав прединициационного комплекса, и стимулируется фактором eIF4B. Однако роль этих факторов, по-видимому, не ограничивается разрушением вторичной структуры лидера, поскольку их присутствие требуется и для инициации синтеза белка на мРНК с короткими 5'UTR, не обладающими выраженной вторичной структурой.
В выборе AUG-кодона у эукариот участвует фактор eIF2. На это указывает тот факт, что его мутационные повреждения сопровождаются ослаблением специфичности такого выбора. Неожиданными оказались недавно полученные результаты, подчеркивающие важную роль фактора eIF5 в распознавании инициирующего кодона прединициационным комплексом. Не исключено, что этот фактор определяет точность процесса распознавания AUG и является функциональным аналогом прокариотического фактора IF3. Описаны мутантные формы eIF5, в присутствии которых in vivo в качестве инициирующего узнается кодон UUG. Не исключено, что совместное действие факторов eIF2 и eIF5 в обеспечении точности выбора инициирующего кодона становится возможным благодаря наличию на ß-субъединице eIF2 сайта связывания eIF5.
После локализации инициирующего кодона 40S субчастицей она приобретает способность объединяться с большой 60S субчастицей рибосом при участии фактора eIF5, что в конечном итоге приводит к образованию полноценного инициационного комплекса. В это время происходит отделение от комплекса ряда факторов инициации трансляции, сопряженное с гидролизом GTP. Прежде всего, освобождается комплекс eIF2–GDP, а также большинство остальных факторов инициации, включая eIF1A и eIF3. В таком виде при наличии соответствующей аминоацил-тРНК инициационный комплекс способен образовывать первую пептидную связь в строящейся полипептидной цепи, т.е. инициировать синтез белка.
Контекст и приоритеты инициирующих AUG-кодонов.Последовательности, окружающие инициирующие AUG-кодоны, оказывают сильное влияние на эффективность инициации трансляции у позвоночных и в значительно меньшей степени у дрожжей. В последнем случае наиболее благоприятным для инициации трансляции является нуклеотид A в положении –3 по отношению к AUG (нуклеотид A в AUG-кодоне находится в положении +1), замена которого на любой другой нуклеотид снижает эффективность инициации приблизительно в два раза. Вообще, A-богатые последовательности, предшествующие AUG, характерны для мРНК дрожжей, что отличает их от мРНК позвоночных, соответствующие области мРНК которых сильнее обогащены GC. Это объясняют высокой чувствительностью аппарата трансляции дрожжей к вторичной структуре 5'UTR их мРНК, которая при наличииGC-пар была бы более прочной. В следующих за AUG последовательностях мРНК дрожжей не обнаружено предпочтения в отношении A, и они, как правило, обогащены пиримидиновыми нуклеотидами.
Оптимальный контекст для инициации трансляции в клетках животных и растений, по-видимому, один и тот же: AACAATGGC. Самыми важными для инициации в обоих случаях являются пурин в положении –3 и G в положении +4. В клетках животных на эффективность трансляции мРНК оказывают влияние также нуклеотиды в положениях +5 и +6. Инициирующие кодоны в контексте, отличающемся от оптимального, узнаются рибосомами менее эффективно и допускают их прохождение до следующего инициирующего кодона. Это явление, обнаруженное в клетках животных и растений, получило название ослабленного сканирования (leaky scanning). Некоторые примеры реализации механизма ослабленного сканирования будут рассмотрены в разделе 3.4.1 (см. рис. I.40,а–в) в связи с особенностями инициации трансляции у вирусов растений.
Другим важным фактором, определяющим выбор AUG-кодона в качестве инициирующего, является его положение в 5'UTR. Как правило, ближайший к 5'-концу мРНК AUG предпочтительно используется для инициации трансляции. Это объясняют преимущественным перемещением сканирующей рибосомы в направлении 5'→3'. Многие 5'UTR содержат дополнительные AUG, не принадлежащие к основным ОРС, а также короткие ОРС (uAUG, uORF) перед основным инициирующим кодоном. И те и другие обычно оказывают ингибирующее действие на трансляцию соответствующих мРНК. Ингибирующий эффект является наиболее сильным, если расстояние первого uAUG от 5'-конца мРНК меньше 15–20 нуклеотидов. Наличие двух следующих друг за другом AUG-кодонов может сопровождаться их использованием в качестве альтернативных сайтов инициации трансляции. В этом случае одна и та же мРНК может направлять синтез двух полипептидов, различающихся лидерными пептидами, что, в свою очередь, может определять направление их внутриклеточного транспорта.
Распознавание инициирующих кодонов в процессе инициации трансляции может сопровождаться продолжительными паузами в дальнейшем перемещении рибосом вдоль мРНК при ее сканировании.
Инициирующие кодоны, отличающиеся от AUG. Трансляция в клетках млекопитающих и насекомых может начинаться на кодонах, которые отличаются от канонического AUG. В природных мРНК в качестве альтернативного инициирующего кодона чаще всего встречается CUG и значительно реже – AUC и ACG. В клетках дрожжей любые не-AUG-кодоны распознаются очень неэффективно. Эффективность может быть повышена мутациями в субъединицах фактора eIF2 и . Кодон AUU обычно открывает первую ОРС у некоторых вирусов растений. В этом случае эффективность инициации трансляции составляет 10% от эффективности на каноническом кодоне AUG, который располагается ниже первого. Таким образом, использование вирусами на одной матрице неканонического и канонического кодонов является одним из регуляторных механизмов, контролирующих соотношение синтезирующихся полипептидных цепей на уровне трансляции позволяющих рибосоме достичь в процессе сканирования второго инициирующего кодона и инициировать на нем синтез белка.
У млекопитающих вышерасположенный неканонический инициирующий кодон также, как правило, сопровождается каноническим кодоном. При этом дополнительная инициация трансляции на неканоническом кодоне чаще всего характерна для ОРС, кодирующих регуляторные белки. Образование по такому механизму полипептидных цепей, удлиненных с N-концевой части, приводит к появлению у них новой регуляторной активности, а сам процесс инициации на неканоническом кодоне может контролироваться условиями внутри клетки.
Влияние вторичной структуры мРНК на инициацию трансляции. Вторичные структуры в 5'UTR мешают сканированию мРНК 40S субчастицами рибосом. Уровень ингибирования инициации трансляции зависит от положения таких структур относительно 5'-конца матрицы. Например, в лизатах ретикулоцитов кроликов структура типа стебель–петля со стабильностью –30 ккал/моль ингибирует инициацию трансляции, если расположена в непосредственной близости от кэп-структуры и не замечается рибосомами при удалении от 5'-конца более чем на 52 нуклеотида. В последнем случае у сканирующего прединициационного комплекса хватает энергии для разрушения этой структуры 5'UTR, но он не может быть собран при наличии шпильки, расположенной в непосредственной близости от кэп-структуры. Тем не менее, шпильки, удаленные от 5'-конца мРНК, могут подавлять трансляцию более чем на 85%, если их стабильность превышает –50 ккал/моль.
Интересно отметить, что структуры типа стебель–петля, образованные вслед за инициирующим AUG-кодоном, могут повышать эффективность инициации трансляции. Полагают, что такие структуры вызывают задержку сканирующего комплекса на инициирующем кодоне, что повышает вероятность его правильного распознавания. Например, элемент вторичной структуры, локализованный на 14 нуклеотидов ниже инициирующего кодона, оказывает стимулирующее влияние на распознавание слабых AUG-кодонов, а также инициирующих кодонов, отличающихся от AUG.
Шунтирование при сканировании мРНК. У некоторых вирусов растений, в частности при трансляции 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), содержащей лидерную последовательность, в процессе инициации имеет место модифицированное сканирование, получившее название рибосомного шунта (см. рис. I.40,г). По этому механизму сканирующие рибосомы могут непосредственно переноситься из донорного в акцепторный сайт на РНК, избегая линейного сканирования расположенной между ними последовательности нуклеотидов. Такое явление было исследовано на искусственных матрицах, содержащих между донорным и акцепторным сайтами последовательности нуклеотидов, образующих интенсивную вторичную структуру. При этом в отсутствие функционирования шунта последовательности обладали ингибирующим действием, точно предсказываемым на основании модели сканирования. Интересно, что шунтирование внутренних последовательностей сканирующими рибосомами может происходить, хотя и с меньшей эффективностью, и in trans, т.е. в условиях, когда донорный и акцепторный сайты располагаются на разных молекулах РНК. Механизмы, лежащие в основе шунтирования, в настоящее время до конца не изучены. Полагают, что ключевую роль в этом могут играть специфические взаимодействия участков РНК, расположенных на больших расстояниях друг от друга. Механизм шунтирования обнаружен при трансляции РНК вируса Сендай, тройной лидерной последовательности аденовирусов, а также у паповавирусов.
Реинициация трансляции.В отличие от прокариотических, мРНК эукариот, как правило, моноцистронны, т.е. содержат только одну основную ОРС. Однако как уже упоминалось выше, часто 5'UTR эукариотических мРНК содержат короткие ОРС. Например, у дрожжей известно несколько сотен видов таких мРНК, и они содержат от одной до шести коротких ОРС, часть из которых может перекрываться. То же самое характерно для мРНК животных. Несмотря на свои малые размеры, короткие ОРС способны обеспечивать инициацию, терминацию и реинициацию трансляции рибосомами эукариот.
Короткие ОРС эукариот играют важную роль в регуляции экспрессии генов на уровне трансляции, о чем подробнее будет говориться в разделе 3.4. Здесь же хочется отметить, что по функциональному признаку короткие ОРС разделяются на две группы: в одних случаях регуляторные функции коротких ОРС не зависят от их кодирующего потенциала, тогда как другие ОРС реализуют свои регуляторные возможности через кодируемые ими пептиды.
В том случае, если короткие ОРС следуют в мРНК друг за другом, рибосомы после завершения трансляции одной из них могут реинициировать синтез белка на следующем инициирующем кодоне. Как и в случае прокариотической трансляции, эффективность реинициации у эукариот в большой степени зависит от расстояния между терминирующим и инициирующим кодоном, а также от нуклеотидного контекста, в котором находится инициирующий кодон.
Инициация на внутренних AUG-кодонах.Третья возможность инициации трансляции у эукариот основана на прямом вхождении рибосом в цикл трансляции независимо от кэп-структур и лидерных последовательностей мРНК при прямом участии их IRES-последовательностей (internalribosomeentrysite). В отличие от классической инициации трансляции у прокариот на внутренних AUG-кодонах полицистронных мРНК, обеспечиваемой последовательностями TIR, IRES-опосредованная инициация происходит не на полицистронных мРНК в обычном смысле, т.е. содержащих последовательности нескольких структурных генов. В этой связи полагают, что основная физиологическая роль инициации трансляции на внутренних AUG-кодонах эукариот заключается в предоставлении некоторым ОРС возможности транслироваться, минуя основной кэп-зависимый механизм инициации. Например, во время вирусной инфекции протеиназа пикорнавирусов отщепляет от полипептидной цепи клеточного фактораeIFGN-концевой пептид, содержащий сайт связывания фактора eIF4E – основного кэп-связывающего белка эукариот. При этом C-концевая часть такого модифицированного фактора сохраняет сайты связывания факторов eIF3 и eIF4A. В результате происходит (неполное) переключение с кэп-зависимой трансляции мРНК клетки-хозяина на кэп-независимую трансляцию вирусных мРНК, опосредованную IRES-последовательностями вирусов.