- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
Вскоре после открытия рибозимов в литературе стала активно обсуждаться гипотеза о каталитической (а не только структурной) функции рРНК в рибосомах. Первые экспериментальные данные в пользу возможной каталитической функции рРНК были получены с ингибиторами биосинтеза белка. Оказалось, что устойчивость к некоторым из них вызывается мутациями в генах рРНК, но не рибосомных белков. Х.Ф. Ноллером и соавторами (1992 г.) было установлено, что удаление из рибосомы большого числа рибосомных белков не инактивирует ее пептидилтрансферазную функцию. Подобного рода данные указывают на то, что именно 23S рРНК является пептидилтрансферазой, однако окончательный вывод мешают сделать оставшиеся рибосомные белки, присутствие которых необходимо для проявления пептидилтрансферазной активности такой ослабленной в структурном отношении рибосомы.
Функциональная связь между рРНК и интронами группы I недавно открылась с неожиданной стороны, когда установили, что аминогликозидные антибиотики, блокирующие биосинтез белка, ингибируют и аутосплайсинг интронов группы I. Это открытие нашло дальнейшее развитие в связи с обнаружением у интронов группы I слабой аминоацилэстеразной активности. Было сделано предположение, что интроны группы I и рибосомная РНК могут обладать общими структурными (и функциональными) доменами. Кроме того, мутантные рибозимы, полученные путем отбора in vitro по критерию ускоренного переноса фосфодиэфирных связей, оказались способными, хотя и в слабой степени, расщеплять амидные связи. На основании такого рода данных Ноллер и соавторы сделали предположение о том, что первые примитивные рибосомы образовались из молекул РНК, родственных интронам группы I, которые были в состоянии осуществлять перенос ацильных групп, необходимый для образования пептидных связей. Таким образом, все эти данные в совокупности позволяли предполагать, что функция рРНК в биосинтезе белка является каталитической, а некоторые РНК сегодняшнего дня, имеющие отношение к обсуждаемым процессам – это "молекулярные ископаемые".
При наличии активированных аминокислот синтез пептидов не представляется трудной задачей. Активированные аминокислоты конденсируются даже в водных растворах с образованием коротких пептидов, а цепи длиной до 50 аминокислот образуются на минеральных поверхностях. Абстрактная схема биосинтеза белка в примитивных системах с участием каталитических РНК представлялась следующим образом. Примитивные РНК, аминоацилирующие сами себя активированными аминокислотами по аутокаталитическому механизму, могут выступать донорами и акцепторами аминокислот в реакциях переноса ацильных групп, катализируемых рибозимами. Для признания РНК в качестве молекул, осуществлявших в примитивных системах синтез белков, необходимо показать возможность выполнения ими следующих функций: узнавание аминокислот, аминоацилирование тРНК, перенос ацильных групп, активация аминокислот и синтез пептидов. Рассмотрим реальность каждого из этих предположений.
Молекулы РНК могут распознавать аминокислоты. По крайней мере, у двух природных РНК (как и у обсуждавшихся выше искусственных аптамеров) обнаружены структурные элементы, способные связывать аминокислоты. Интроны группы I связывают аргинин в области спирали Р7 (см. рис. I.15,а). Вторым примером является трансактивируемый район (trans-activating region – TAR) ВИЧ, который специфически взаимодействует с белком-трансактиватором tat во время вирусной инфекции. Этот участок ВИЧ-РНК также обладает способностью взаимодействовать с аргинином. Кроме того, известно, что редактирующая функция аминоацил-тРНК-синтетаз (разрушение связи между ошибочно соединенными аминокислотой и тРНК) включает опосредованное РНК распознавание аминокислот. Предполагается, что в процессе редактирования имеют место непосредственные контакты РНК с аминокислотами. Более того, в системах с искусственным отбором РНК из пула молекул со случайными последовательностями удалось получить четыре различных аргининсвязывающих структурных элемента (аптамера) с разным уровнем специфичности. С помощью того же подхода были выделены акцептирующие цитруллин аптамеры, а также другие молекулы РНК, взаимодействующие с более гидрофобными аминокислотами – валином и триптофаном.
Спонтанное аминоацилирование РНК. Процесс аминоацилирования тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами in vivo происходит в два этапа: вначале фермент активирует соответствующую аминокислоту с образованием 5’-аминоациладенилата, который затем атакуется 2’(3’)-концом тРНК, что сопровождается возникновением соответствующей ковалентной связи между аминокислотой и тРНК. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей. Недавно тем же методом селекции из пула случайных РНК, представленного 1,7·1014 молекулами, были получены рибозимы, способные при наличии активированных аминокислот спонтанно аминоацилироваться. Пул РНК инкубировали при 0о с химически синтезированным фенилаланил-5’-аденилатом в присутствии ионов Mg2+ и Ca2+. Аминоцилированные РНК обнаруживали по появлению свободной -аминогруппы фенилаланина. Молекулы РНК, меченные такими гидрофобными группами, очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенной фазе. После 11 циклов отбора были получены спонтанно аминоацилирующиеся РНК со скоростью, в 105 раз превышающей скорость реакции в контроле. Распознавание аминокислоты рибозимом было слабым, поскольку образование специфических комплексов рибозима с субстратом обнаружить не удалось.
Перенос ацильных групп, катализируемый РНК. Повсеместное использование аминоациладенилатов и аминоацилированных тРНК при трансляции в природных условиях указывает на возможную роль РНК в ранних системах трансляции. Действительно, способность рибозимов к спонтанному аминоацилированию позволяет предполагать и возможность их участия в следующем этапе биосинтеза белка – переносе аминоацильной группы с донорной молекулы на свою собственную акцепторную, т.е. в осуществлении аминоацилтрансферазных реакций. Такая активность была обнаружена среди 1015 молекул РНК случайной структуры, подвергнутых искусственному отбору на протяжении нескольких циклов. В этой системе отбора в качестве донора аминоацильной группы был использован гексануклеотидный фрагмент РНК, содержащий на 2’(3’)-конце активированный остаток N-биотинилированного метионина. С помощью стрептавидин-агарозы отбирали молекулы РНК, способные переносить ацильную группу на свою собственную 5’-гидроксильную группу. Подобные рибозимы, среди которых доминировали однотипные молекулы, были получены после 11 циклов отбора.
Анализ первичной структуры таких рибозимов обнаружил вблизи 3’-концов наличие высококонсервативной внутренней матрицы, которая обладала способностью связывать и приводить в контакт друг с другом 2’(3’)-конец донорной молекулы и акцепторный 5’-конец своей собственной полинуклеотидной цепи. Рибозимы оказались не просто матрицей. Они действительно катализировали перенос ацильных групп, ускоряя этот процесс в 103 раз (kкат = 9,4·10-2 мин-1) по сравнению с системами, в которых была задействована только матрица. Интересно, что два неправильно спаренных основания G–U в месте стыковки дуплексов донор–матрица и акцептор–матрица оказались необходимыми для функционирования рибозимов, стимулируя реакцию переноса ацильной группы в 10 раз.
Образование амидных связей, опосредованное рибозимами. Рибозимы, конструирование которых было описано выше, катализировали реакцию трансэтерификации карбоксиэфиров. Для проверки возможности образования этими рибозимами амидных связей их 5’-концевые гидроксильные группы заменяли на аминогруппы. Оказалось, что такие рибозимы с высокой эффективностью осуществляют перенос биотинилированного метионина с 2’(3’)-конца гексануклеотида-субстрата на свою собственную 5’-концевую аминогруппу. Константа скорости первого порядка реакции образования амидной связи (0,58 мин-1) была лишь в 15 раз ниже таковой (8 мин-1), осуществляемой природной пептидилтрансферазой рибосом с использованием фрагмента аминоацилированной тРНК.
РНК-центрический взгляд на происхождение трансляции и самой жизни. Получение аптамеров, способных специфически распознавать аминокислоты, и рибозимов, аминоацилирующих самих себя, явилось серьезным аргументом в пользу ключевой роли РНК в происхождении трансляции. Если предположить, что РНК могут мобилизовать энергию макроэргических связей ATP, то в скором времени будут обнаружены и рибозимы, активирующие аминокислоты путем синтеза соответствующих аминоациладенилатов. Следуя тем же аргументам, можно надеяться на скорое получение рибозимов, способных синтезировать пептиды. Если все основные стадии синтеза белка будут осуществляться рибозимами, то, по мнению А. Хагер и соавторов (1996 г.), можно предположить следующие этапы эволюционирования системы трансляции. Вначале синтез пептидов выполняется рибозимами, не обладающими высокой специфичностью по отношению к своим субстратам – донорам и акцепторам аминоацильных групп. Некоторые пептиды могли начать синтезироваться после приобретения рибозимами специфичности в отношении выбора субстратов. Хотя этот громоздкий механизм для образования каждой пептидной связи в синтезируемом пептиде требует собственного рибозима, однако он не кажется абсурдным, так как до сих пор бактерии используют такой принцип для синтеза некоторых своих пептидов (например молекулы грамицидина) с помощью специфического набора ферментов. Активность рибозимов могла быть повышена с помощью коротких РНК, объединяющих субстраты друг с другом. После эволюционного возникновения таких кофакторных РНК требования к специфичности рибозимов, синтезирующих пептиды, будут снижаться, и в конце концов появится истинная пептидилтрансфераза в виде 23S рРНК. Как известно, рРНК функционирует в тесной связи с матрицей мРНК, которая специфически сближает донорные и акцепторные аминоацил-тРНК.
Все рассмотренные аргументы подчеркивают важную, если не исключительную, роль РНК в происхождении жизни на Земле. Большинство современных ферментов являются белками, а все известные рибозимы действуют на РНК-субстраты. Уже одно это показывает, что цепь событий, приведшая к такому повороту развития эволюционных преобразований живых систем, остается до конца не понятой. Лабораторные методы, позволяющие моделировать эволюционирование рибозимов in vitro, дают возможность продолжить экспериментальное исследование глобального вопроса о происхождении жизни.