- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
Транскрипция у любого организма является первым этапом реализации генетической информации – экспрессии генов. Однако первичные транскрипты, как правило, представляют собой лишь предшественники зрелых мРНК – пре-мРНК, которые перед выполнением своих функций должны претерпеть многочисленные изменения, называемые посттранскрипционными модификациями. Кроме того, у эукариот зрелые мРНК должны быть доставлены от места их биосинтеза (ядра) к месту трансляции (цитоплазматическим рибосомам), т.е. экспортироваться из ядра в цитоплазму.
Одной из наиболее удивительных посттранскрипционных модификаций пре-мРНК является редактирование их первичной структуры. В результате посттранскрипционно изменяется смысл генетической информации, заключенной в соответствующем гене.
Посттранскрипционные модификации РНК особенно характерны для эукариотических организмов, у которых в силу мозаичной интрон-экзонной структуры их генов первичные транскрипты представлены гигантскими предшественниками, включающими в себя последовательности как экзонов, так и интронов. 5’-Конец предшественника мРНК чаще всего подвергается котранскрипционным модификациям, в результате которых к его 5’-концевому нуклеотиду особым образом присоединяется остаток гуанозина с образованием "шапочки" – кэпа. Эта котранскрипционная модификация создает условия для прохождения следующего этапа процессинга мРНК – сплайсинга, сопровождающегося вырезанием последовательностей интронов и объединением экзонов с образованием непрерывной кодирующей последовательности мРНК. Одновременно от 3’-конца путем эндонуклеазного расщепления отделяется избыточный фрагмент РНК, и к оставшейся части присоединяется поли(А)-последовательность. Эта совокупность реакций получила название полиаденилирования мРНК. После таких котранскрипционных и посттранскрипционных модификаций пре-мРНК образовавшаяся зрелая, стабилизированная мРНК переносится из ядра в цитоплазму, часто к специфическому месту своей внутриклеточной локализации, где может быть депонирована или эффективно транслироваться рибосомами. Каждый из этапов посттранскрипционных модификаций может использоваться для регуляции уровня экспрессии соответствующих генов.
Процессинг рнк у бактерий
мРНК прокариот обычно являются полицистронными, т.е. включают в себя последовательности нуклеотидов нескольких генов одного оперона (рис. I.10,а). Полицистронные мРНК бактерий при выполнении своих функций матричных РНК в трансляции не требуют разбиения на последовательности отдельных генов и могут транслироваться непосредственно рибосомами с образованием функционально активных белков. Исключением из правила являются полицистронные ранние мРНК нечетных T-бактериофагов Т3 и Т7, которые после транскрипции in vivo расщепляются до моноцистронных под действием РНКазы III, специфически гидролизующей двухцепочечные РНК. Участие этого фермента в процессинге указывает на наличие характерной вторичной структуры РНК на границах транскриптов отдельных генов вышеупомянутых бактериофагов, что и было обнаружено после определения их первичной структуры.
РНКаза III участвует также в процессинге предшественников рРНК у E. coli, поскольку 5S, 16S и 23S рРНК исходно синтезируются в составе общего первичного транскрипта. При этом в спейсерных участках 30S предшественников между последовательностями 16S и 23S рРНК расположены тРНК. Кроме того, у бактерий обнаружены транскрипты генов тРНК, содержащие до шести тРНК в составе одного предшественника. В процессинге предшественников тРНК у бактерий ключевую роль играет РНКаза P. Для проявления нуклеазной активности у этого необычного фермента требуется присутствие небольшой РНК, прочно ассоциированной с его полипептидной цепью. Именно ей присуща собственная эндонуклеазная активность, что характерно и для других рибозимов (подробнее см. главу 9). Таким образом, зрелые молекулы рРНК и тРНК образуются в клетках как прокариот, так и эукариот в результате серии эндо- и экзонуклеазных воздействий на их предшественники. Основной же посттранскрипционной модификацией является полиаденилирование их 3’-концевых последовательностей.
Полиаденилирование РНК у бактерий. Хотя поли(А)-полимераза E. coli, осуществляющая безматричный синтез поли(А) при наличии РНК-затравок, была очищена в 1962 г., поли(А)-РНК у бактерий не была обнаружена до 1975 г.
Рис. I.10. Локализация сайтов полиаденилирования и пути катаболизма бактериальных РНК
а– обобщенная структура бактериальной полицистронной мРНК и положение сайтов полиаденилирования в РНК классов I-VI;б– альтернативные пути катаболизма бактериальных мРНК с участием поли(А)-полимеразы, полинуклеотидфосфорилазы (ПНФазы) и различных РНКаз; РНКаза Х – гипотетическая рибонуклеаза
и долгое время после этого рассматривалась как исключение из общего правила и биологический курьез. В настоящее время стало ясно, что полиаденилирование РНК у бактерий столь же обычно, как и у эукариот, и выполняет важные биологические функции. Поли(А)-последовательности бактериальных мРНК значительно короче соответствующих эукариотических. Их длина, в среднем, составляет всего 14–16 нуклеотидов (80–200 – у эукариот), а полиаденилированы лишь от 1 до 40% молекул мРНК каждого определенного вида в клетке (100% в случае эукариот). Более подробное сравнение свойств поли(А)-последовательностей прокариот и эукариот проведено в разделе 2.2.3.
Классы поли(А)-содержащих РНК бактерий. В зависимости от расположения сайта присоединения поли(А)-последовательности все бактериальные РНК разделяют на шесть классов (см. рис. I.10,а). В РНК первого класса происходит полиаденилирование 3’-концевого нуклеотида, следующего сразу за терминаторной шпилькой -независимого терминатора последней кодирующей области. У РНК второго класса терминаторная шпилька отщепляется посттранскрипционно РНКазой Е, и к образующемуся 3’-концу присоединяется поли(А). Терминаторная шпилька отсутствует и у полиаденилированных мРНК третьего класса, образующихся с участием -зависимых терминаторов транскрипции, благодаря особенностям структуры таких терминаторов. В укороченных мРНК четвертого класса отсутствует 3’-концевая кодирующая область, а поли(А) начинается непосредственно за межцистронной терминаторной шпилькой. В РНК пятого класса поли(А)-последовательности локализуются на концах укороченных цистронов, а у РНК шестого класса – на концах 5’-концевых некодирующих последовательностей. На основании структуры поли(А)+-мРНК делается вывод, что полиаденилирование у бактерий не зависит от присутствия в РНК специфических регуляторных сигналов, как это имеет место у эукариот, а определяется наличием у них свободных 3’-OH-групп. Такие промежуточные мРНК разной длины, по-видимому, появляются в результате деградации или преждевременной терминации синтеза полноразмерных транскриптов.
Поли(А)-полимеразы. Полиаденилирование бактериальных мРНК катализирует поли(А)-полимераза (ATP:полирибонуклеотид-аденилилтрансфераза), которая осуществляет независимое от матрицы последовательное присоединение остатков аденилата к 3’-OH-концам молекул РНК в соответствии со следующей реакцией:
РНК + nATP РНК(А)n + nPPi
У E. coli описаны две поли(А)-полимеразы. Поли(А)-полимераза I кодируется локусом pcnB, первоначально идентифицированным в качестве контролирующего число копий плазмид в бактериальных клетках. Процессированная молекула представляет собой полипептид с молекулярной массой 52 кДа, не обладающий гомологией с соответствующими эукариотическими ферментами, однако содержащий сегмент, гомологичный части полипептидной цепи тРНК-нуклеотидилтрансферазы, которая осуществляет посттранскрипционное присоединение акцепторного CCA-тринуклеотида к молекулам тРНК. Даже умеренная сверхэкспрессия рекомбинантного гена pcnB летальна для E. coli. Полная инактивация гена pcnB с помощью делеций не сопровождается прекращением полиаденилирования мРНК, что указывает на присутствие в геноме E. coli второго аналогичного гена. Такой ген был обнаружен в виде открытой рамки считывания f310, кодирующей полипептид с молекулярной массой 36,3 кДа, обогащенный гидрофобными аминокислотами. Полипептид не обладает гомологией ни с одной из известных бактериальных, вирусных или эукариотических поли(А)-полимераз.
Возможная функциональная роль полиаденилирования РНК у бактерий. Несмотря на то что полиаденилирование РНК интенсивно исследуется более 25 лет, его функциональная роль даже у эукариот полностью не выяснена. Еще меньше известно о роли полиаденилирования РНК у бактерий. Однако из имеющихся данных становится ясно, что влияние полиаденилирования РНК на молекулярные процессы бактериальной клетки весьма разнообразно и распространяется, по крайней мере, на контроль числа копий бактериальных плазмид, стабильность мРНК и ее трансляцию.
Регуляция репликации плазмид через полиаденилирование антисмысловых РНК. Более подробно механизмы регуляции репликации бактериальных плазмид будут рассмотрены в разделе 4.2.2 на примере плазмиды ColE1. Здесь же лишь кратко отметим, что у некоторых групп плазмид, например ColE1 или pBR322, которая является ее производной, регуляция числа копий осуществляется с помощью антисмысловой РНК (РНК I), образующей гибрид с РНК-праймером (РНК II), необходимым для инициации их репликации, и блокирует его функционирование. В соответствии с этим внутриклеточная концентрация РНК I является критическим параметром в регуляции репликации плазмид. Деградация РНК I инициируется отщеплением 5’-концевого пентануклеотида под действием РНКазы Е (РНК I–5) и далее контролируется поли(А)-полимеразой – продуктом гена pcnB. Полиаденилированная РНК I–5 обладает коротким временем полужизни, типичным для бактериальных мРНК (1–2 мин), тогда как немодифицированная РНК I–5 значительно более стабильна (время полужизни – >10 мин). Ускоренная деградация поли(А)-РНК I–5 инициируется полинуклеотидфосфорилазой. У поли(А)--РНК I–5 3’-концевой нуклеотид находится в составе шпильки, что препятствует эффективному действию полинуклеотидфосфорилазы. Однако при наличии короткого поли(А)-хвоста, выступающего за пределы шпильки, РНК I–5 эффективно расщепляется ферментом по 3’-экзонуклеазному механизму. В разрушение поли(А)+-РНК I–5 вносят свой вклад и другие нуклеазы, включая РНКазу Е и РНКазу III. Имеются данные и том, что полиаденилирование само по себе инактивирует РНК I–5, так как оно приводит к характерному изменению ее вторичной структуры.
Влияние полиаденилирования на время полужизни бактериальных мРНК. Описанное выше дестабилизирующее действие полиаденилирования на антисмысловые РНК распространяется и на некоторые бактериальные мРНК. Например, инактивация гена pcnB, кодирующего поли(А)-полимеразу, с помощью делеций сопровождается значительным увеличением времени полужизни мРНК генов lpp, trxA, ompA, а также rpsO на фоне мутаций pnp, rnb и rne, инактивирующих гены полинуклеотидфосфорилазы и соответствующих рибонуклеаз. Поскольку эти результаты были получены в отсутствие РНКазы Е, 3’-концы большинства бактериальных мРНК содержали шпильку, характерную для -независимых терминаторов транскрипции (см. рис. I.10). Экзонуклеазное расщепление РНК под действием полинуклеотидфосфорилазы и РНКазы II затруднено при наличии такой шпильки и облегчается в присутствии выступающей поли(А)-последовательности (см. рис. I.10,б). Как показано на рисунке, первичный транскрипт в бактериальных клетках может или полиаденилироваться, или подвергнуться экзонуклеазному расщеплению, неэффективному без поли(А)-последовательности, при наличии которой в процесс деградации активно включаются полинуклеотидфосфорилаза и РНКаза II. РНКаза Е может отщеплять как полиаденилированную, так и неполиаденилированную шпильку. Такой незащищенный с 3’-конца транскрипт подвергается атаке 3’-экзонуклеаз, с которой конкурирует полиаденилирование, препятствующее деградации мРНК по этому механизму. Следовательно, полиаденилирование мРНК в бактериальных клетках может выполнять альтернативные функции: дестабилизировать транскрипты при наличии у них 3’-концевых шпилек и стабилизировать "линейные" формы мРНК. Предполагается участие в деградации поли(А)+-мРНК и неизвестной РНКазы Х, поскольку этот процесс может происходить на фоне неактивных полинуклеотидфосфорилазы, РНКазы II и РНКазы Е.
Изображенная на рис. I.10 схема катаболизма первичных бактериальных транскриптов является упрощением, так как предполагает независимое действие нуклеаз. В последнее время, в соответствии с общей тенденцией, накапливаются данные о координированной работе большинства компонентов системы деградации бактериальных РНК в составе сложных мультиферментных комплексов, получивших название деградосом. Полное расщепление РНК с 3’-концевой шпилькой деградосомами требует расхода ATP ATP-зависимой РНК-хеликазой, а также участия белка DnaK, белков теплового шока, энолазы и гликолитического фермента с неизвестной функцией в метаболизме РНК.
Возможная роль полиаденилирования бактериальных мРНК в трансляции. Как будет видно из дальнейшего изложения (см. раздел 2.2.3), поли(А)-последовательности эукариотических РНК постоянно ассоциированы с жизненно важным поли(А)-связывающим белком PAB, который участвует как в регуляции стабильности мРНК, так и их трансляции. Поиск белка с аналогичными функциями у бактерий привел к очистке рибосомного белка S1, который кооперативно связывается с поли(А)-последовательностями мРНК с константой ассоциации 3·106 М–1. Функциональная роль этого взаимодействия в настоящее время не ясна, однако предполагают, что оно может оказывать влияние на трансляцию. Возможно, белок S1 облегчает доставку мРНК к 30S субчастицам рибосом, что должно стимулировать инициацию трансляции.
Полиаденилирование мРНК в митохондриях и хлоропластах. Концепция эндосимбиотического происхождения митохондрий и хлоропластов эукариот из бактерий-эндосимбионтов подкреплена многочисленными экспериментальными данными и является в настоящее время весьма популярной. В этой связи целесообразно рассмотреть особенности полиаденилирования РНК у этих органелл в данном разделе. Полиаденилированные мРНК митохондрий по своей структуре аналогичны мРНК E. coli класса IV (см. рис. I.10,а). Как и у бактерий, полиаденилирование митохондриальных РНК происходит вне зависимости от специфических регуляторных последовательностей, характерных для мРНК эукариот. Средний размер поли(А)-последовательностей мРНК митохондрий в клетках HeLa человека составляет 55 нт, а в клетках асцитных опухолей мышей – 35–55 нт, что соответствует длине поли(А)-последовательностей у бактерий. Поли(А)-полимераза митохондрий клеток гепатомы Морриса обладает молекулярной массой 60 кДа. Она способна добавлять к РНК in vitro поли(А)-последовательности длиной до 600 нт, однако в изолированных митохондриях их размер составляет 20–23 нт. Фермент кодируется ядерным геном.
Длина 3’-концевых поли(А)-последовательностей РНК хлоропластов значительно превышает таковую РНК бактерий и достигает нескольких сотен нуклеотидов, что характерно для эукариотических поли(А)+-РНК. Эти последовательности не обязательно являются гомополимерами остатков аденозина, но могут состоять из кластеров А (75%), перемежающихся последовательностями G (24%), а также C и U (суммарное содержание – 5%), что напоминает свойства некодирующих, обогащенных поли(А) участков мРНК бактериофага Т7. Поли(А)-полимераза хлоропластов гороха (Pisum sativum) состоит из трех субъединиц, среди которых полипептид с молекулярной массой 43 кДа обладает антигенными детерминантами, общими с поли(А)-полимеразой дрожжей, а из двух других гликозилированных субъединиц лишь РНК-связывающий полипептид с молекулярной массой 105 кДа абсолютно необходим для функционирования фермента.