2. Использование антисмысловых рнк

Получение фенокопий. Клетки или организмы, обладающие фенотипом мутантных клеток или организмов, сформировавшимся не вследствие мутаций, называют фенокопиями. Развитие техники антисмысловых РНК позволило исследовать функции отдельных клонированных генов, дифференциально экспрессирующихся в процессе онтогенеза животных. Экспрессия антисмысловых РНК в клетках организма на определенных стадиях его развития может сопровождаться понижением внутриклеточного уровня соответствующих белков или ферментов, что имитирует процесс мутационной инактивации их генов. Одним из примеров использования антисмысловых РНК для получения фенокопий у мышей были исследования роли гена основного белка миелина (ОБМ) в онтогенезе.

Получение трансгенных мышей, экспрессирующих антисмысловые РНК гена ОБМ, который содержался в количестве десяти копий на геном, сопровождалось понижением на 80% внутриклеточного содержания этого белка. Примерно половина потомства мышей приобретала фенотип shiverer через две недели после рождения. Такой фенотип, для которого характерна непрерывная дрожь конечностей, был впервые описан у мышей, гомозиготных по рецессивной мутации в гене ОБМ. Однако для мутантных фенотипов подобных фенокопий была характерна значительная вариабельность, а также имели место мозаицизм в распределении в мозге клеток, содержащих ОБМ (т.е. лишь часть клеток содержала ОБМ), и гетерогенность в отношении уровня экспрессии этого гена. В табл. II.3 суммированы результаты экспериментов по получению фенокопий у мышей, проведенных к 1996 г.

Антисмысловые РНК могут быть использованы и для получения мутантных фенотипов, не описанных ранее из-за отсутствия соответствующих генетических мутантов. Например, введение посредством трансгеноза самкам дрозофилы антисмыслового гена рибосомного белка RpA1, находящегося под контролем промотора теплового шока, сопровождалось нарушением оогенеза при повышенной температуре (37^о). При 18^o, когда экспрессия антисмысловых РНК резко снижена, уменьшалось и образование дефектных яиц. Проявление мутантного фенотипа в этом случае зависело от времени индукции антисмысловых РНК, дозы (количества) антисмыслового гена и уровня его транскрипции. Таким образом, в данной работе было подтверждено известное наблюдение, что для проявления мутантного фенотипа в некоторых случаях нет необходимости в полной инактивации функции соответствующего гена.

Таблица II.3

Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей

Гены-мишени	Длина micРНК, п.о.	Мишень в гене	Фенотип
Основной белок миелина	1200	Экзоны	Понижение уровня мРНК на 80%; мыши shiverer
ГФРТ	1390	5'-НТ, экзон 1 и интрон 1	Понижение уровня мРНК на 20–50%; активность фермента не изменилась
»	550	То же	Эффект отсутствовал
-Последовательность мышиного вируса лейкемии Молони	540	-Область	Снижение числа лейкозов у зараженных мышей с 31% до 0%
Рецептор глюкокортикоидов типа II	1815	3'-НТ	Понижение уровня мРНК в мозге на 50–70%; уменьшение содержания рецептора
-Цепь иммуноглобулина А	100	5'-НТ и инициирую-щий кодон	Понижение уровня мРНК на 50%; задержка созревания В-клеток
Фактор роста нервов	1300	Экзоны	Изменение базального уровня фактора роста нервов в коже
wnt-1	4700	Экзоны	Понижение уровня мРНК на 98%
Gi2	39	5'-НТ и инициирую-щий кодон	Понижение уровня белка в печени и жировой ткани на 95%, уменьшение скорости роста тела

Таблица II.3 (окончание)

Гены-мишени	Длина micРНК (п.о.)	Мишень в гене	Фенотип
Белок нуклеокапсида вируса гепатита мышей	1800	Экзоны	Повышение устойчивости к вирусной инфекции
GLUT-2	1489	»	Понижение уровня белка GLUT-2 на 80%
Интерлейкин 3	990	»	Понижение уровня IL-3, приводящее к развитию лимфопролиферативных заболеваний -клеток
Миниген COLIA1	1200	»	Понижение уровня белка COLIA1 на 50%, приводящее к летальной ломкости костей
Ангиотензиноген	1900	»	До индукции промотора – повышение уровня мРНК в печени; после индукции – понижение уровней мРНК в печени и почках и повышение в мозге на 20 дней, после чего уровни нормализуются; понижение уровня ангиотензиногена в плазме через 30 дней после индукции
Глюкокиназа -клеток	1900	»	Понижение уровня мРНК в -клетках, сопровождаемое 50%-ным снижением активности глюкокиназы, повышение уровня глюкозы в крови

Использование антисмысловых РНК для исследования онтогенеза животных выявило высокую чувствительность определенных его стадий к изменению уровня экспрессии генов, а также неспецифическую токсичность антисмысловых транскриптов, проявляющуюся за счет взаимного влияния различных частей ранних эмбрионов друг на друга и гетерогенности экспрессии самих антисмысловых РНК в развивающихся зародышах. Это затрудняет интерпретацию результатов, полученных при экспрессии антисмысловых РНК в раннем эмбриогенезе. Поэтому более удобными объектами для получения фенокопий являются культивируемые соматические клетки животных и растений.

Исследование клеточного цикла. Антисмысловые РНК оказались полезными в исследованиях роли протоонкогенов и факторов роста в пролиферации клеток. С использованием такого подхода были изучены протоонкогены c-fos, c-myc, c-src, антионкоген p53. В норме уровень экспрессии c-myc выше в пролиферирующих клетках, чем в дифференцирующихся. В присутствии антисмысловых олигонуклеотидов наблюдали понижение внутриклеточного уровня белка c-Myc в клетках линии HL60, что сопровождалось понижением скорости роста клеток и усилением миелоидной дифференцировки. Природные антисмысловые c-myc-РНК были обнаружены среди транскриптов клеток мышей. Антисмысловые c-fos-РНК предотвращали повторное вхождение покоящихся клеток 3Т3 (фаза G_o) в клеточный цикл.

Противовирусная терапия. Внутриклеточная экспрессия антисмысловых РНК, направленных против мРНК некоторых ключевых вирусных белков, может эффективно подавлять вирусную инфекцию. Этот результат был впервые получен с клетками E. coli, содержащими плазмиды, которые экспрессировали антисмысловые РНК, комплементарные различным участкам генов бактериофага SP. Бактериальные клетки приобретали иммунитет к фагу в наибольшей степени в том случае, если антисмысловые РНК были комплементарны 5’-концевым последовательностям мРНК (включая последовательности Шайна–Дальгарно) гена белка созревания. Менее эффективными оказались антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белков оболочки бактериофага или его репликазы. 15-Нуклеотидная антисмысловая последовательность, комплементарная сайту связывания рибосом мРНК, на 94% подавляла выход фага SP и оказывала значительный ингибирующий эффект на развитие родственных фагов Q и GA. Эти опыты показали принципиальную возможность использования антисмысловых РНК для борьбы с вирусными инфекциями. Кроме того, высокая специфичность антисмысловых РНК по отношению к вирусным последовательностям нуклеотидов сводит к минимуму возможные цитотоксические и другие побочные действия. Современные методы генной инженерии позволяют вводить гены антисмысловых РНК в клетки зародышевой линии животных и растений, что может обеспечивать наследование этих генов в ряду поколений.

Обнадеживающие результаты были получены в опытах по ингибированию развития вируса саркомы Рауса (ВСР) в клетках перепелов. Антисмысловые РНК, комплементарные мРНК белка оболочки ВСР, на 70–80% предотвращали внутриклеточное развитие ВСР, дефектного по белку оболочки, в присутствии плазмиды, экспрессирующей этот белок, которая без антисмысловой РНК комплементировала развитие дефектного вируса.

Были получены трансгенные растения табака, которые содержали экспрессирующий вектор, направляющий синтез антисмысловой РНК, комплементарной мРНК белка оболочки вируса мозаики огурцов (ВМО). Такие растения оказались устойчивыми к ВМО только при низкой множественности инфекции, а иммунитет к ВМО мог быть преодолен с помощью высоких концентраций инокулируемого вируса. Аналогичные результаты были получены с трансгенными растениями табака, экспрессирующими антисмысловые РНК, комплементарные транскрипту гена белка оболочки X. В этих опытах уровень экспрессии антисмысловых РНК оказался недостаточным для того, чтобы обеспечить полную устойчивость растений к вирусной инфекции, что требует дальнейшей оптимизации условий экспрессии генов антисмысловых РНК в клетках растений.