- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Прокариотические системы
Среди прокариотических бесклеточных белоксинтезирующих систем наибольшее распространение получили системы на основе экстрактов клеток E. coli, хотя основные принципы, используемые для их получения, могут быть применены и для других бактериальных клеток. Прокариотическая, как и любая другая бесклеточная система биосинтеза белка, должна содержать несколько обязательных компонентов: 1) рибосомы и белковые факторы трансляции; 2) матричный полирибонуклеотид (мРНК или синтетические полинуклеотиды); 3) аминоацилированные тРНК; 4) GTP в качестве источника энергии; 5) одновалентные (К+ или NH4+) и двухвалентные (Mg2+ или Са2+) катионы, а также буферные вещества для поддержания рН системы в физиологических пределах.
Одним из наиболее важных условий функционирования бесклеточных систем биосинтеза белка является нативное состояние рибосом и факторов трансляции. В качестве источников этих компонентов в бактериальных бесклеточных системах чаще всего используют экстракты соответствующих клеток. Бактериальные клетки выращивают на богатой питательной среде, суспендируют в буфере и разрушают тем или иным способом. Лизат центрифугируют при 30 000 g. При этом в супернатанте (так называемом SЗО-экстракте) остаются рибосомы и остальные белковые факторы трансляции, необходимые для функционирования системы. Кроме того, в нем содержатся бактериальные ДНК и мРНК, которые, если от них не освободиться, приводят к неспецифическому синтезу белка в бесклеточной системе.
В том случае, если разрушение бактериальных клеток проводят жесткими методами с применением ультразвука, растирания со стеклянными бусами и т.п., освобождение от эндогенных нуклеиновых кислот становится сложной задачей и требует фракционирования экстрактов с помощью ионообменной хроматографии. При такой хроматографической очистке фракции S1OO из нее удаляются все аминоацилированные и свободные молекулы тРНК. Поэтому при реконструировании бесклеточной белоксинтезирующей системы к объединенным фракциям рибосом и S1OO-экстракта добавляют препарат очищенной суммарной тРНК.
Экстракты бактериальных клеток S30 и S1OO, кроме всех необходимых факторов трансляции, содержат и основные компоненты системы транскрипции, включая РНК-полимеразу, фактор терминации транскрипции , CRP-белок и т.п. Поэтому для создания ДНК-зависимой системы сопряженной транскрипции и трансляции, в которой происходит полная экспрессия генов, находящихся под контролем бактериальных регуляторных элементов, как правило, не требуется введения в нее дополнительных белков. Достаточно внесения в систему экзогенной ДНК-матрицы, транскрибируемой бактериальной РНК-полимеразой, а также четырех рибонуклеозидтрифосфатов, чтобы в ней начала активно синтезироваться мРНК и одновременно транслироваться рибосомами. В итоге в таких бесклеточных системах в ряде случаев удается синтезировать высокомолекулярные белки, обладающие ферментативной активностью.
Экстракты бактериальных клеток содержат многочисленные нуклеазы и протеолитические ферменты, которые понижают эффективность синтеза белков in vitro, разрушая мРНК и образуемые полипептиды. Для преодоления этих затруднений в бесклеточных системах часто используют экстракты мутантных бактериальных клеток, дефектных по РНКазам и полинуклеотидфосфорилазе, а в сами бесклеточные системы при необходимости вводят ингибитор РНКазы из плаценты человека или ингибиторы протеиназ: лейпептин, пепстатин, химостатин и т.п.
Не существует больших ограничений на первичную структуру мРНК, транслируемых в бактериальных бесклеточных системах. Единственным необходимым условием их эффективной трансляции является отсутствие совершенной вторичной структуры или каких-либо особо прочных кооперативных спиральных участков. Вторичную структуру транслируемых мРНК обычно разрушают кратковременным прогреванием с последующим быстрым охлаждением непосредственно перед внесением ее в пробы.
GTP относится к обязательным компонентам бесклеточной белоксинтезирующей системы. Он не может быть заменен на любой другой из известных рибонуклеозидтрифосфатов и необходим для мРНК-зависимого связывания аминоацил-тРНК с рибосомами и транслокации. Поскольку при трансляции происходит непрерывное расходование GTP, а образующийся при этом GDP является ингибитором трансляции, в процессе функционирования бесклеточной системы осуществляют постоянную регенерацию GTP. Для этого применяют АТР в качестве донора фосфатных групп, которая, в свою очередь, регенерируется путем переноса фосфатной группы вводимого в бесклеточную систему фосфоэнолпирувата с помощью пируватфосфокиназы. Энергия макроэргических связей АТР используется также при аминоацилировании тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами. В том случае, если создается бесклеточная система сопряженной транскрипции и трансляции, для осуществления синтеза РНК в нее вводятся еще два недостающих рибонуклеозидтрифосфата: UTP и СТР.
Для функционирования бесклеточных белоксинтезирующих систем необходимо обеспечивать в них определенные ионные условия. Наиболее существенным фактором в этом случае является концентрация ионов Mg2+. Достаточно изменения оптимальной концентрации Mg2+ в системе на 1–2 мМ, чтобы в ней перестали синтезироваться полипептиды, обладающие ферментативной активностью. При этом влияние ионов Mg2+ на суммарное включение аминокислот в синтезируемые полипептидные цепи проявляется в меньшей степени, что, по-видимому, объясняется нарушением точности включения аминокислот в белки при неоптимальных концентрациях ионов Mg2+. В системах in vitro ионы Mg2+ могут быть заменены на ионы Са2+ и даже Мn2+, а также частично замещены полиаминами: спермидином или спермином, которые благоприятно влияют на трансляцию и образование нативных белков.
Биосинтез белка в бесклеточных системах происходит также в присутствии ионов K+ или NH4+, оптимальные концентрации которых составляют 100 мМ. Ионы Na+ ингибируют трансляцию, а ацетат-анионы в используемых солях предпочтительнее анионов Сl-. Ионы Mg2+, К+ и NH4+ необходимы для ассоциации субчастиц рибосом и поддержания их в компактной форме, а также обеспечения других их функций.
Несмотря на то что в бесклеточной трансляции чаще всего находят применение системы с использованием SЗО- и S1OO-экстрактов с добавленными рибосомами, современный уровень знаний молекулярных механизмов трансляции позволяет получать бесклеточные белоксинтезирующие системы из полностью очищенных компонентов. Однако создание таких систем является трудоемким процессом, поэтому их применяют только в аналитическом варианте для решения специальных задач.