- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
Во время редупликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки разветвления и локализован функционирующий репликативный комплекс. Современные представления о строении репликативной вилки E. coli схематически изображены на рис. I.46,а. В соответствии с этой моделью, ДНК-хеликаза перемещается в репликативной вилке впереди ДНК-синтезирующего белкового комплекса и расплетает цепи родительской ДНК, причем SSB-белок связывается с образующимися одноцепочечными участками, облегчая процесс расплетения.
Рис. I.46. Схема функционирующей репликативной вилки E. coli и эукариот и основных этапов репликации ДНК
а– репликативная вилка с основными белками репликации, в которой димер ДНК-полимеразы синхронно реплицирует обе цепи ДНК;б– этапы репликации (1–8) отстающей цепи ДНК. Этап 7 у эукариот является гипотетическим
Из-за антипараллельности и комплементарности цепей ДНК механизм репликации этих двух цепей существенно различается. Действительно, ДНК-полимераза обладает способностью синтезировать ДНК только в одном направлении: от 5’-конца к 3’-концу, перемещаясь вдоль ДНК-матрицы в направлении 3’5’. В то же время комплементарные цепи ДНК противоположно направлены (антипараллельны), и в силу своих свойств ДНК-полимераза не может реплицировать молекулу ДНК, просто перемещаясь от одного конца матричного дуплекса к другому. Для разрешения этого противоречия репликативный комплекс использует изящный механизм. На одной цепи ДНК синтез новой цепи происходит непрерывно, и образующаяся цепь называется ведущей, тогда как синтез другой цепи осуществляется прерывисто в виде коротких фрагментов, получивших название фрагментов Оказаки в честь ученого, впервые их открывшего. Эта вновь синтезируемая цепь ДНК называется отстающей. И хотя фрагменты Оказаки также синтезируются в направлении 5’3’, перемещение работающей ДНК-полимеразы вдоль матричной цепи ДНК при синтезе каждого индивидуального фрагмента Оказаки должно быть противоположным тому, которое имеет место в случае синтеза ведущей цепи. Образующиеся фрагменты Оказаки отстающей цепи далее соединяются друг с другом с помощью ДНК-лигазы.
Репликативный комплекс, который осуществляет синтез ведущей цепи ДНК, включает в себя минимальный (кор-) фермент ДНК-полимеразы III (белок 43 в случае фага Т4), подвижный связывающий -белок с молекулярной массой 41 кДа ("sliding clamp", белок 45 у фага Т4) и белки -комплекса, состоящего из пяти полипептидов ‘ (скрепляющие белки – brace proteins). Функциональным аналогом белков -комплекса у бактериофага Т4 служит комплекс белковых продуктов генов 44/62. При облучении клеток E. coli УФ-светом в них индуцируется синтез укороченного *-белка (26 кДа), который является продуктом того же гена, что и -субъединица холофермента ДНК-полимеразы III. По-видимому, функциональная роль *-белка заключается в обеспечении репликации ДНК на матрице, поврежденной УФ-светом.
При синтезе ведущей цепи ДНК репликативный комплекс E. coli функционирует весьма эффективно с высокой процессивностью. Напомним, что мерой процессивности является длина фрагмента вновь синтезированной макромолекулы, которую комплекс (или индивидуальные ферменты) способен образовывать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы. Установлено, что холофермент ДНК-полимеразы III, в состав которого входят минимальный фермент (субъединицы , и ), -белок, белки -комплекса и -белок, синтезирует ведущую цепь ДНК длиной в 50000 нуклеотидов со скоростью >500 нуклеотидов в секунду в одном цикле, ни разу не диссоциируя от ДНК-матрицы. Точность репликации ДНК холоферментом ДНК-полимеразы III поражает воображение. Частота ошибочных включений нуклеотидов не превышает 10-9–10-10 на нуклеотид за один раунд репликации. В то же время очищенные каталитические субъединицы реплицируют ДНК с пониженной точностью. В частности, изолированная -субъединица допускает ошибки в опытах in vitro с частотой 6 10-1 на нуклеотид за один раунд репликации. Частота ошибок, возникающих в ДНК, облученной УФ-светом, одна и та же в ведущей и отстающей цепях вновь синтезируемой ДНК in vivo.
Роль -комплекса заключается в распознавании РНК-затравок (праймеров) на матричной ДНК. -Комплекс связывается с единственным праймером ведущей цепи ДНК или с каждым из праймеров фрагментов Оказаки отстающей цепи, что, в свою очередь, делает возможным присоединение к промаркированным таким образом праймерам минимального фермента ДНК-полимеразы и -белка (см. рис. I.46,б).
Две молекулы -белка входят в состав репликативного комплекса вслед за белками -комплекса, связываясь с ДНК позади белков -комплекса и оставляя 3’-конец праймера доступным для ДНК-полимеразы. Димер -белка образует кольцо вокруг молекулы ДНК и стимулирует АТРазную активность белков -комплекса. Как уже упоминалось выше, функциональный аналог -белка – продукт гена 45 бактериофага Т4, образует такую же пространственную структуру, охватывающую молекулу ДНК тремя молекулами. Молекулярная масса белка 45 составляет 2/3 от таковой -мономера, и их аминокислотные последовательности негомологичны друг другу. Тем не менее, четвертичные структуры этих полипептидов и механизмы их функционирования обладают большим сходством.
-Белки и белки -комплекса, будучи связанными с дуплексом праймер–матрица, обеспечивают присоединение к этому комплексу минимального фермента ДНК-полимеразы. Затем ДНК-полимераза при наличии доступных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, используя праймер для инициации синтеза ДНК, с высокой эффективностью синтезирует цепь ДНК, комплементарную ДНК-матрице. Те же самые белки участвуют и в синтезе отстающей цепи ДНК. В этом случае прерывистый синтез ДНК многократно инициируется на большом количестве праймеров, и ДНК синтезируется в виде фрагментов Оказаки длиной ~1000 нт. Синтез затравок, представляющих собой короткие последовательности РНК, обеспечивает продукт гена dnaG (белок 61 фага Т4). ДНК-полимераза начинает элонгацию цепей ДНК, присоединяя первый дезоксирибонуклеозидмонофосфат к 3’-концевому нуклеотиду РНК-затравки. В процессе элонгации участвуют -белок и белки -комплекса, которые перемещаются вдоль молекулы ДНК вместе с каталитической субъединицей ДНК-полимеразы.
Ведущая и отстающая цепи ДНК реплицируются координированно, что обеспечивается димеризацией ДНК-полимеразных комплексов. В таком димере, который образуется при участии -белка, один ДНК-полимеразный комплекс осуществляет непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, а другой – фрагментов Оказаки отстающей цепи. Для димеризации ДНК-полимеразы III E. coli необходим -белок, в то время как продукт гена 43 бактериофага Т4, по-видимому, изначально находится в виде димера. Другое различие репликативных комплексов E. coli и фага Т4 заключается в том, что холофермент ДНК-полимеразы E. coli (субъединицы ·‘···) сохраняется в виде стабильного комплекса и в отсутствие ДНК, тогда как холофермент Т4-ДНК-полимеразы существует только в присутствии матрицы.
Необычность ситуации во время синтеза ДНК в репликативной вилке заключается в том, что один и тот же белковый комплекс осуществляет как высоко процессивный непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, так и прерывистый синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи, претерпевая во втором случае периодическую диссоциацию от матрицы для инициации синтеза ДНК с каждого нового праймера. Для объяснения такого парадокса предположили, что холофермент ДНК-полимеразы способен узнавать 5’-конец каждого РНК-праймера, встречающегося после завершения синтеза очередного фрагмента Оказаки во время образования отстающей цепи ДНК в процессе репликации. Недавно с помощью оригинального экспериментального подхода удалось решить этот вопрос. В участок полипептидной цепи -белка, контактирующий с минимальным ферментом ДНК-полимеразы III, методами генной инженерии ввели аминокислотную последовательность, узнаваемую и фосфорилируемую протеинкиназой. Измеряя скорость фосфорилирования этих сайтов в условиях избытка протеинкиназы во время синтеза ДНК in vitro, определили кинетику ассоциации и диссоциации комплексов -белок–ДНК-полимераза по изменению уровня защищенности сайтов фосфорилирования от действия протеинкиназы. Полученные результаты интерпретировали таким образом, что во время связанного с синтезом фрагментов Оказаки перемещения минимального фермента ДНК-полимеразы и -комплекса вдоль одноцепочечной ДНК-матрицы, покрытой SSB-белком, оба белка прочно связаны с -белком и матрицей. При встрече репликативного белкового комплекса с дуплексом, образованным матричной ДНК и РНК-затравкой, -белок остается связанным с вновь синтезированной ДНК, а у отделившихся ДНК-полимеразы и белков -комплекса появляется возможность вступить в новый цикл синтеза фрагмента Оказаки путем взаимодействия с очередным дуплексом РНК-затравка–матрица. При этом вхождение ДНК-полимеразы в новый репликативный комплекс облегчается наличием в нем -белка и белков -комплекса, ассоциированных с очередным РНК-праймером. Таким образом, холофермент ДНК-полимеразы III обладает способностью распознавать молекулярное окружение, создаваемое матричной ДНК, осуществлять терминацию синтеза ДНК при наличии сигнала в виде дуплекса ДНК–затравка и реинициировать синтез ДНК на следующем праймере. В итоге одна и та же молекула ДНК-полимеразы III в составе реплицирующего комплекса способна проводить синтез всех фрагментов Оказаки отстающей цепи реплицируемой ДНК, последовательно осуществляя инициацию, терминацию и реинициацию синтеза каждого из них.
После очередной терминации синтеза ДНК отстающей цепи 3’-конец вновь синтезированной ДНК оказывается вплотную приближенным к 5’-концу праймера следующего фрагмента Оказаки. Для соединения двух фрагментов с помощью ДНК-лигазы необходимы предварительное удаление РНК-праймера и достройка цепи ДНК в образующейся бреши. РНК-затравка удаляется с помощью РНКазы H, нуклеазы, специфически расщепляющей РНК в ДНК–РНК-гибридах, и(или) с участием 5’3’-экзонуклеазы ДНК-полимеразы I. Во втором случае одновременно с удалением праймера происходит застройка образующейся бреши той же ДНК-полимеразой. В итоге два соседних фрагмента Оказаки вплотную приближаются друг к другу и оказываются отделенными лишь одноцепочечным разрывом, который может репарироваться ДНК-лигазой. В настоящее время остается открытым вопрос о механизмах координации удаления РНК-праймеров из фрагментов Оказаки с самим процессом репликации ДНК.
Кроме вышеупомянутых дуплексов праймеры–ДНК, холоферменты бактериальных и фаговых ДНК-полимераз, по-видимому, способны адекватно реагировать на другие стерические препятствия, возникающие на пути следования вдоль реплицируемой молекулы ДНК. В частности, ДНК-полимераза фага Т4 в процессе репликации может расходиться с транскрибирующими ту же ДНК молекулами РНК-полимеразы, не диссоциируя из репликативного комплекса и не вытесняя РНК-полимеразу с матрицы. Кроме того, репликативный комплекс может распознавать повреждения ДНК, возможно, маркированные специфическими белками, и прекращать репликацию соответствующего участка, останавливаясь или диссоциируя от матрицы. Репликация таких участков ДНК возобновляется после ликвидации повреждений ферментами репаративной системы. Для диссоциировавшей ДНК-полимеразы это становится возможным благодаря тому, что 3’-конец вновь синтезированной цепи ДНК в месте остановки репликации остается связанным с -белком, который облегчает повторное вхождение диссоциировавшей ДНК-полимеразы в репликативный комплекс.