- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Передача сигнала и вторичные мессенджеры
Жизнь любой клетки, включая глобальные процессы ее роста, деления и даже гибели, зависит от внешних регуляторных сигналов, которые она воспринимает. Такими сигналами могут быть физические воздействия (температура, ионизирующее и другое электромагнитное излучение) или многочисленные химические соединения. Хорошо изученными веществами, которые организм использует для регуляции жизнедеятельности клеток, являются, например стероидные гормоны, цитокины или факторы роста, которые, достигая клеток-мишеней, вызывают в них специфические метаболические изменения, связанные в том числе и с изменением экспрессии больших групп генов. Не менее сильный и часто также специфический ответ вызывают различные физиологически активные вещества экзогенного происхождения, например феромоны или токсины.
Все эти сигналы, передающиеся через соответствующие сигнальные молекулы, являются первичными по отношению к тем каскадам биохимических реакций, которые запускаются в клетках в ответ на их воздействие. Первичные сигналы распознаются клетками благодаря наличию у них специальных молекул-рецепторов белковой природы, взаимодействующих с первичными сигнальными молекулами или воздействиями физической природы. Первичный сигнал, как правило, не действует прямо на те метаболические процессы в клетке, для регуляции которых он предназначен. Вместо этого воспринимающий его рецептор инициирует образование в клетке промежуточных химических соединений, запускающих внутриклеточные процессы, воздействие на которые было целью первичного внеклеточного сигнала. Поскольку такие промежуточные соединения несут в себе информацию о первичном регуляторном сигнале и являются вторичными его переносчиками, они получили название вторичных мессенджеров. Ими могут быть различные ионы, циклические нуклеотиды, продукты деградации липидов и целый ряд других химических соединений биогенного происхождения.
Использование эукариотами системы вторичных мессенджеров переводит их на новый уровень интеграции всех метаболических и катаболических процессов, что необходимо для существования многоклеточных организмов. В частности, вторичные мессенджеры позволяют многократно усиливать первичный регуляторный сигнал от внеклеточных регуляторных молекул, которые благодаря этому осуществляют свое действие, находясь в небольших концентрациях во внеклеточном пространстве. Кроме того, многие группы клеток и тканей приобретают способность к однотипной и одновременной реакции на первичный регуляторный сигнал, например на действие гормона какого-либо органа эндокринной системы. Это обеспечивает возможность быстрой адаптации многоклеточного организма к изменяющимся условиям внутренней и окружающей среды.
Трансмембранный перенос первичных сигналов. Для того чтобы первичный регуляторный сигнал достиг ядра и оказал свое воздействие на экспрессию генов-мишеней, он должен пройти через двухслойную мембрану именно тех клеток, которым он предназначен. Как правило, это достигается благодаря наличию на поверхности клеток рецепторов белковой природы, специфически выбирающих из окружающей среды сигналы, распознать которые они в состоянии (рис. I.22). В простейшем случае, когда в качестве низкомолекулярных регуляторов выступают гидрофобные химические соединения, растворимые в липидах мембран (например стероидные гормоны), для их переноса не используются рецепторы, и они проникают в клетку путем радиальной диффузии. Внутри клеток такие соединения специфически взаимодействуют с белковыми рецепторами, а образующийся комплекс переносится в ядро, где оказывает свое регуляторное воздействие на транскрипцию соответствующих генов (см. рис. I.22,а).
В отличие от этого рецепторы мембран, ориентированные во внеклеточное пространство, обладают способностью осуществлять транспорт лиганда-регулятора внутрь клеток посредством эндоцитоза (поглощения путем втягивания мембраны) комплекса лиганд-рецептор в составе мембранных везикул. Такой механизм используется, в частности, для переноса внутрь клеток молекул холестерина, ассоциированных с рецепторами липопротеинов низкой плотности (см. рис. I.22,б). Другой тип рецепторов, ориентированных на внеклеточные лиганды, – это трансмембранные молекулы или группа молекул. Взаимодействие с лигандом внешней части таких молекул сопровождается индукцией ферментативной активности, ассоциированной с внутриклеточной частью того же самого полипептида (см. рис. I.22,в). Примерами подобных рецепторов, обладающих активностью тирозиновых протеинкиназ, являются рецепторы инсулина, эпидермального фактора роста или фактора роста тромбоцитов. В синапсах нейронов и местах контакта нейромышечных тканей лиганды-нейромедиаторы (например ацетилхолин или -аминомасляная кислота) взаимодействуют с трансмембранными ионными каналами (см. рис. I.22,г). В ответ на это происходит открытие ионных каналов, сопровождаемое перемещением ионов через мембрану и быстрым изменением трансмембранного электрического потенциала. Другие трансмембранные рецепторы осуществляют связь белков внеклеточного матрикса с микрофиламентами цитоскелета клеток и регуляцию формы клеток, зависящую от внеклеточного матрикса, их подвижности и роста (см. рис. I.22,д). Наконец, большая группа внеклеточных сигналов распознается рецепторами, ассоциированными на внутренней поверхности мембраны с GTP-связывающими белками, которые, в свою очередь, в ответ на первичный сигнал начинают синтез вторичных мессенджеров, регулирующих активность внутриклеточных белков (см. рис. I.22,е). Классификация по структурному признаку рецепторов, осуществляющих перенос сигнала в клетки через мембраны, приведена в табл. I.12.
Рис. I.22. Способы передачи внеклеточных регуляторных сигналов через мембраны эукариотических клеток (а–е)
Y и Y–P – нефосфорилированные и фосфорилированные остатки Tyr в белках соответственно. Показано также превращение предшественника X во вторичный мессенджер Z
Все рецепторы, участвующие в трансмембранной передаче сигнала, подразделяют на три класса. При этом, как правило, учитывается сходство или различие вторичных структур субъединиц, а не особенности их аминокислотных последовательностей. Рецепторы 1-го класса образуют олигомерные структуры вокруг пор в мембранах. Перенос сигнала в этом случае происходит в результате открытия или (в одном случае) закрытия ионных каналов. Основная часть рецепторов 2-го класса погружена в мембраны, и каждая из субъединиц содержит последовательности, распознаваемые G-белками (см. ниже). Для всех субъединиц этого класса характерно наличие трансмембранной (ТМ) последовательности, которая 7 раз пересекает мембрану. Субъединицы рецепторов 3-го класса минимально погружены в мембраны, что обеспечивает подвижность рецепторов и возможность их интернализации (перехода в цитоплазму клеток в составе мембранной везикулы). Большая часть полипептидных цепей этих субъединиц экспонирована наружу клеток.
Вторичные мессенджеры. Гипотеза о том, что действие гормонов на метаболизм клеток и экспрессию генов опосредуется внутриклеточными вторичными мессенджерами, впервые появилась после открытия в конце 1950-х годов Е. Сазерлендом циклического аденозин-3’,5’-монофосфата (cAMP). К настоящему времени список вторичных мессенджеров расширился и включает циклический гуанозин-3’,5’-монофосфат, фосфоинозитиды, ионы Ca2+ и H+, метаболиты ретиноевой и арахидоновой кислот, закись азота (NO), а также некоторые другие химические соединения биогенного происхождения. Подробное рассмотрение особенностей механизма действия каждого из них выходит за рамки данной монографии, хотя все они могут оказывать специфическое влияние на экспрессию генов.
Таблица I.12