- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации 17
- •Предисловие автора
- •Часть I. Механизмы хранения и реализации генетической информации введение
- •Средний размер гаплоидного генома у некоторых групп организмов
- •Гены и хромосомы
- •Геном прокариот
- •Геном вирусов
- •Нуклеоид бактериальной клетки
- •Геном архебактерий
- •Минимальный размер генома одноклеточных организмов
- •Геном эукариот
- •Последовательности нуклеотидов эукариотического генома
- •Хроматин
- •Свойства гистонов животных
- •Роль днк-топоизомераз в обеспечении структуры и функционирования хроматина
- •Реализация генетической информации при экспрессии генов
- •Транскрипция
- •Днк-зависимые рнк-полимеразы
- •Характеристики белковых компонентов холофермента рнк-полимеразы II дрожжей
- •Единицы транскрипции (транскриптоны)
- •Этапы транскрипции
- •Субъединичный состав и характеристика основных факторов транскрипции (gtf) рнк-полимеразы II человека
- •Основные факторы элонгации рнк-полимеразы II
- •Хроматин во время транскрипции
- •Субъединичный состав и свойства белковых комплексов Swi/Snf и nurf
- •Котранскрипционные и посттранскрипционные модификации рнк
- •Процессинг рнк у бактерий
- •Редактирование пре-мРнк
- •Различные способы редактирования мРнк
- •Редактирование рнк у животных и их вирусов
- •Другие модификации эукариотических мРнк
- •Сравнение полиаденилирования мРнк у эукариот и прокариот
- •5’-Концевой сайт Точка 3’-Концевой сайт
- •5’–Экзон 1guaugu__...__uacuaac__...__(Py)nAgэкзон 2–3’
- •Механизм прямой и обратной реакций аутосплайсинга интронов группы I
- •Кэп-связывающий комплекс в роли фактора, сопрягающего основные реакции метаболизма транскриптов рнк-полимеразы II
- •Функциональная компартментализация ядра
- •Интерфазные хромосомы в ядре
- •Ядрышко
- •Пространственная организация синтеза мРнк
- •Ядерные тельца и домены
- •Компартментализованное ядро
- •Биосинтез белка рибосомами бактерий
- •Рибосомы
- •Этапы биосинтеза белка
- •Антибиотики, действующие на уровне трансляции
- •Трансляция у эукариот
- •Особенности первичной структуры эукариотических мРнк
- •Инициация биосинтеза белка эукариотическими рибосомами
- •Элонгация полипептидных цепей
- •Терминация трансляции
- •Трансляция в митохондриях
- •Трансляция в хлоропластах.
- •Основные пути регуляции экспрессии генов
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у прокариот
- •Регуляция на уровне инициации транскрипции
- •Регуляция синтеза рнк на уровне элонгации и терминации
- •Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции у эукариот
- •Передача сигнала и вторичные мессенджеры
- •Рецепторы мембран, осуществляющие трансмембранный перенос сигнала
- •Механизмы позитивной регуляции транскрипции
- •Классификация факторов транскрипции
- •Функциональные домены факторов транскрипции
- •Механизмы негативной регуляции транскрипции
- •Структура хроматина как специфический регулятор экспрессии генов
- •Импринтинг
- •Метилирование днк в регуляции транскрипции
- •Факторы транскрипции позвоночных, на активность которых оказывает влияние метилирование остатков цитозина в узнаваемых ими регуляторных последовательностях нуклеотидов
- •Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов
- •Направленный транспорт, внутриклеточная локализация и депонирование мРнк
- •Сплайсинг рнк в регуляции экспрессии генов
- •Избирательная деградация мРнк
- •Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции
- •Регуляция инициации трансляции
- •Регуляция элонгации синтеза полипептидных цепей
- •Регуляция терминации трансляции
- •Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина
- •Посттрансляционная регуляция экспрессии генов
- •Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей
- •Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков
- •Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков
- •Сплайсинг белков
- •Другие посттрансляционные модификации белков
- •Воспроизведение генетической информации
- •Репликация днк
- •Белки, участвующие в репликации днк
- •Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов
- •Репликативная вилка e. Coli и бактериофага t4
- •Особенности функционирования репликативной вилки эукариот
- •Эукариотические днк-полимеразы и их функциональные гомологи у прокариот
- •Регуляция репликации днк
- •Инициация репликации днк у e. Coli и ее регуляция
- •Регуляция репликации плазмиды ColE1
- •Особенности репликации линейных геномов
- •Линейные хромосомы бактерий
- •Репликаторы эукариот
- •Репликация теломерных участков эукариотических хромосом
- •Пространственная организация синтеза днк у эукариот
- •Защита генетической информации
- •Мутации
- •Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности
- •Основные классы алкилирующих агентов
- •Метаболиты нормальной микрофлоры человека, обладающие мутагенной и канцерогенной активностями
- •Sos-мутагенез у бактерий
- •Мутаторный фенотип
- •Экспансия днк
- •Адаптивные мутации
- •Механизмы защиты генома от мутаций
- •Репарация днк
- •Основные механизмы репарации поврежденной днк
- •Эксцизионная репарация в клетках животных
- •Днк-гликозилазы и эндонуклеазы клеток микроорганизмов и человека, участвующие в ber
- •Белки животных, участвующие в ner
- •Гомологичная рекомбинация в репарации днк
- •Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов
- •Полимераза поли(adp-рибозы) в репарации днк у эукариот
- •Альтруистичная днк
- •Парадокс возможности существования многоклеточных организмов
- •Повышение информационной стабильности генома избыточными последовательностями
- •Селективная защита генов от мутаций
- •Высокоупорядоченное расположение летальных генов на хромосомах
- •Возможный смысл парадокса с
- •Современная концепция гена
- •Часть II основные направления развития прикладной молекулярной генетики Введение
- •Часть II. Искусственные генетические системы
- •Принципы генной инженерии
- •Основные ферменты, используемые в генной инженерии
- •Рестриктазы и днк-метилазы
- •Эффективность расщепления коротких последовательностей днк некоторыми распространенными рестриктазами
- •Днк- и рнк-лигазы
- •Ферменты матричного синтеза днк и рнк
- •Частота ошибок при синтезе днк, осуществляемом термостабильными днк-полимеразами in vitro при проведении пцр в оптимальных условиях
- •Другие ферменты
- •Векторы
- •Плазмидные векторы
- •Векторы на основе фага
- •Космиды и фазмиды
- •Сверхъемкие векторы yac, bac и pac
- •Интегрирующие и челночные (бинарные) векторы
- •Конструирование экспрессирующих векторов и их функционирование
- •Векторы для переноса днк в клетки животных и растений
- •Клонотеки генов
- •Получение клонотек генов
- •Введение рекомбинантных днк в клетки
- •Методы скрининга клонотек генов
- •Эукариотические системы экспрессии рекомбинантных генов, основанные на культурах клеток
- •Клетки яичников китайских хомячков (линия cho)
- •Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
- •Клетки селезенки мышей (линия mel)
- •Клетки африканской зеленой мартышки (линия cos)
- •Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
- •Сравнение эффективности рассмотренных систем экспрессии
- •Бесклеточные белоксинтезирующие системы
- •Прокариотические системы
- •Эукариотические системы
- •Проточные системы
- •Другие современные методы исследования генов
- •Рестрикционное картирование генов
- •"Прогулки и прыжки по хромосомам"
- •S1-картирование рнк и днк
- •Футпринтинг
- •Стратегия выделения нового гена
- •Направленный мутагенез и белковая инженерия
- •Методы направленного получения мутаций
- •Получение делеций и вставок
- •Химический мутагенез
- •Сайт-специфический мутагенез с использованием олигонуклеотидов
- •Полимеразная цепная реакция в направленном мутагенезе
- •Белковая инженерия
- •Библиотеки пептидов и эпитопов
- •Белки-репортеры в гибридных белках
- •Гибридные токсины
- •Подходы к созданию новых ферментов
- •Субтилигаза в лигировании пептидов
- •Концепция ксенобиоза
- •Антисмысловые рнк, рибозимы и дезоксирибозимы
- •Антисмысловые рнк и олигонуклеотиды
- •Механизм действия антисмысловых рнк
- •Использование антисмысловых рнк
- •Влияние экспрессии антисмысловых рнк на фенотип трансгенных мышей
- •Природные антисмысловые рнк
- •Антисмысловые рнк и патология: возможный механизм возникновения доминантных мутаций
- •Рибозимы и дезоксирибозимы
- •Типы рибозимов
- •Свойства рибозимов
- •Рибозимы как лекарственные средства
- •Репарация мутантных рнк с помощью рибозимов, осуществляющих транс-сплайсинг
- •Дезоксирибозимы
- •Аптамеры
- •Молекулы рнк у истоков жизни
- •Молекулы рнк в качестве рнк-репликаз
- •Возможность синтеза полипептидных цепей молекулами рнк
- •Трансгенные животные и растения
- •Способы получения трансгенных многоклеточных организмов
- •Экспрессия трансгенов
- •Использование трансгенов у животных
- •Исследование механизмов экспрессии генов
- •Токсигены в исследовании дифференцировки соматических клеток в онтогенезе
- •Изменение физиологического статуса лабораторных и сельскохозяйственных животных
- •Моделирование наследственных и приобретенных заболеваний человека
- •Трансгенные растения
- •Генотерапия наследственных и приобретенных заболеваний
- •Способы доставки новых генов в геном человека
- •Управление экспрессией трансгенов в клетках-мишенях
- •Современные достижения генотерапии онкологических заболеваний
- •Ближайшие перспективы использования генотерапии
- •Успехи генотерапии в модельных экспериментах
- •Проблемы, возникающие в связи с практическим применением генотерапии
- •Днк-диагностика и днк-типирование
- •Днк-диагностика наследственных и приобретенных заболеваний
- •Получение клинического генетического материала
- •Диагностика заболеваний
- •Днк-типирование
- •Днк-типирование микроорганизмов
- •Идентификация личности на основе минисателлитной днк: определение отцовства
- •Микроматрицы и микрочипы днк
- •Методы создания микроматриц днк
- •Ограничения в использовании микроматриц днк
- •Использование микроматриц днк в фундаментальных и прикладных исследованиях
- •Картирование и определение первичной структуры генома человека
- •Основные подходы к картированию генома человека
- •Генетические карты сцепления
- •Современные методы построения генетических карт сцепления
- •Пцр в исследованиях генома человека
- •Физические карты низкого разрешения
- •Физические карты высокого разрешения
- •Определение полной первичной структуры днк генома человека
- •Базы данных получаемой информации
- •Заключение
- •Рекомендуемая литература
Предисловие автора
Мы можем понять что-то в природе, только если мы размышляем о ней…
Вернер Гейзенберг
Предметные исследования, осознанно устремляясь к границам и истокам нашего бытия, становятся философскими.
Карл Ясперс
Направления молекулярной генетики, основанные на генной инженерии, начало которым было положено в 1970-х годах работами В. Арбера, П. Берга, Г. Бойера, С. Коэна и других зарубежных ученых, получили в последующие 25 лет стремительное развитие, открывшее новые горизонты биологической науки. Сегодня трудно представить себе какой-либо раздел молекулярной биологии или генетики, в котором не применялись бы достижения этих исследований. Области использования методов молекулярной генетики непрерывно расширяются, все больше охватывая, к примеру, фундаментальную и клиническую медицину, судебно-следственную практику и даже палеонтологию. Однако все эти достижения – лишь внешняя, хорошо видимая часть айсберга. Замена поврежденных генов на здоровые в генотерапии и "клонирование" многоклеточных организмов придают нашей жизни совершенно новое, грозное качество, так как ставят перед человечеством неведомые ранее этические проблемы. Для меня несомненно, что именно с 70-х годов XX в. начался новый этап эволюции биосферы Земли, все последствия которого мы еще не в состоянии предвидеть.
Работая, как и большинство из нас, в узкой области молекулярной генетики, я часто затрачивал значительные усилия на поиск сведений о каком-либо новом методе или молекулярном механизме, описание которых можно найти иногда лишь в труднодоступной англоязычной литературе. Постоянное общение с коллегами показывает, что блуждания по научной литературе в поисках ответа на теоретические вопросы, возникающие в процессе экспериментальной работы, не являются исключительно моими трудностями. Поэтому стремление сохранить время и облегчить жизнь коллегам-экспериментаторам было одной из движущих сил, заставивших написать эту книгу.
Однако не только указанная причина побудила меня взяться за перо. Оборотной стороной лавинообразного накопления научной информации является размывание контуров целостной картины современных молекулярно-генетических знаний. В соответствии с формулировкой Г. Вейля (берущей начало от Г. Галилея), метод естественных наук включает в себя пассивное наблюдение, уточняемое с помощью активного эксперимента, и построение символической конструкции, к которой в конечном счете сводятся естественно-научные теории. Высшей формой символической конструкции является математическая формула. На пути к своей цели – символической конструкции, непротиворечиво объединяющей эмпирические факты, – естественно-научные теории неизбежно проходят предварительные стадии, в том числе и стадию классификации или морфологии.
То, что в основном происходит сегодня в нашей молодой области биологии, напоминает скрупулезные усилия ботаников или зоологов-систематиков, стремящихся как можно полнее описать фауну и флору нашей планеты. Открываются все новые и новые гены, ферменты, биохимические механизмы и метаболические пути, которые переплетаются в сложнейшие сети. Миллиарды пар оснований отсеквенированных последовательностей ДНК призваны внести ясность в наше понимание структуры и функционирования генома. И хотя это совершенно закономерный и необходимый этап развития науки, одних только эмпирических фактов явно недостаточно для наступления ясности.
Складывающуюся ситуацию, в частности хорошо иллюстрирует положение в современной онкологии. Громадные усилия и средства, затрачиваемые в мире на изучение молекулярных механизмов канцерогенеза, приносят обильные плоды в виде новых генов и белков-регуляторов клеточного цикла, передачи сигнала и механизмов регуляции апоптоза. Однако прямолинейные попытки управления экспрессией этих конкретных генов с помощью антисмысловых РНК, рибозимов, анти-генов и других современных молекулярно-генетических подходов пока не привели к удовлетворительным результатам в генотерапии онкологических (и каких-либо других системных) заболеваний. Заболеваемость раком, в том числе и в промышленно развитых странах, непрерывно возрастает и по прогнозам Всемирной организации здравоохранения к 2020 году удвоится. Пока не слишком успешными остаются и попытки борьбы со СПИДом. Такого рода факты ясно показывают, насколько далеки мы сегодня от понимания живого организма как целого.
Кроме эмпирических фактов требуются новые обобщающие идеи и в конечном счете фундаментальные символические конструкции, которые бы продвинули генетику на пути понимания законов генетического контроля жизнедеятельности клетки и организма в целом. В этой связи не менее важной целью написания книги была попытка систематизировать современные достижения в исследовании механизмов регуляции экспрессии генов на всех основных уровнях реализации генетической информации и обсудить ряд новых концепций, рожденных в ходе исследований. Я надеялся, что некоторые не слишком широко известные факты в свою очередь помогут генерировать новые знания. Однако книга не является полностью компилятивной. Наряду с современной классикой в ней представлены и результаты оригинальных исследований, которые включают, в частности концепции ксенобиоза и альтруистичной ДНК, а также гипотезы о функциональном значении редактирования РНК на посттранскрипционном уровне и образовании доминантных мутаций с участием антисмысловых РНК.
Книга состоит из двух частей. В первой части рассматриваются молекулярные механизмы, обеспечивающие хранение генетической информации живых организмов и ее реализацию через экспрессию генов. При этом основное внимание уделяется генетическим системам эукариот. Поскольку любой ген существует благодаря передаче его точной копии соматическим клеткам и в ряду поколений организмов, в конце первой части обсуждаются механизмы репликации ДНК, репарации ее повреждений, а также другие способы стабилизации генетической информации.
Вторая часть книги посвящена обсуждению современных достижений молекулярной генетики в ее прикладных областях. Однако использование термина "прикладные" в этом контексте не совсем корректно. Результаты, полученные в исследованиях трансгеноза, рибозимов или при решении задач белковой инженерии изменили облик всей современной генетики и потребовали пересмотра многих теоретических представлений.
К сожалению, ограничения в объеме книги не позволили реализовать в ней первоначально задуманную главу "Гены и фенотип", а также обсудить современные достижения в исследовании рекомбинации ДНК. По тем же причинам упомянуты не все авторы, работы которых обсуждаются в монографии. Им я приношу свои глубокие извинения. Исчерпывающую библиографию можно найти в современных обзорах из списка рекомендованной литературы, которая предназначена для более глубокого знакомства с предметом.
На протяжении всей книги мне хотелось подчеркнуть единство генетических систем организма. Отдельное рассмотрение систем транскрипции, трансляции, репарации или репликации условно, поскольку их функционирование в клетке тесно взаимосвязано. На это указывает, в частности высокая интеграция многочисленных механизмов внутриклеточной передачи сигнала, полифункциональность отдельных белков и ферментов, колоссальное разнообразие летальных мутаций и плейотропность действия генов.
Работая над книгой, я всегда имел в виду, что ясное представление о целом может быть хорошим помощником в исследовании частных генетических проблем. Но и сама генетика является лишь малой частью творения духа человека. В лаборатории, клинике, на пленэре или в мастерской мы пишем этюды к большой картине, которой, к счастью, никогда не суждено быть завершенной. И в те редкие минуты, когда работа идет особенно хорошо, отчетливо ощущаешь причастность к этому великому движению духовных сфер, во многом определяющему смысл нашей жизни.
В заключение предисловия хочется выразить особую признательность дирекции и Ученому совету Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН за оказанную поддержку в издании книги.
Работа над книгой проходила параллельно с экспериментальными исследованиями в стенах лаборатории биотехнологии ИБХ, руководимой А.И. Мирошниковым, в лице которого я нашел полное понимание. За это я хочу принести ему свою искреннюю благодарность.
Мое мировоззрение как генетика начало складываться и во многом определилось в аспирантуре на семинарах Р.Б. Хесина, а также при личном общении с этим замечательным человеком и сотрудниками его лаборатории. Ко всем этим людям, ученым и учителям, с которыми мне посчастливилось работать в начале жизненного пути, я храню чувство глубокой благодарности.
Я отдаю себе отчет в том, что монография никогда не была бы написана без высокого профессионализма, постоянного интереса и дружеского участия заведующей научно-информационным отделом Института Т.И. Соркиной, от которой исходит сама идея этого издания. В долгих и плодотворных дискуссиях с ней обсуждалась общая структура книги и содержание отдельных глав, а также многочисленные технические детали, о которых перед началом работы я, к сожалению, не имел ни малейшего представления. Одновременно я приношу свою глубокую благодарность сотрудникам отдела В.В. Егоровой, Т.И. Яковлевой, И.М. Приваловой и Л.И. Петровой за большую техническую помощь при подготовке рукописи к печати.
Хотелось бы выразить искреннюю признательность Е.Д. Свердлову за жесткую и конструктивную критику первых двух глав монографии, которая оказала сильное влияние на всю дальнейшую работу над книгой. Сейчас невозможно представить себе выход монографии в свет без учета многочисленных глубоких замечаний Ю.А. Берлина, у которого я многому научился в ходе нашего продолжительного общения.
Пользуясь случаем, хотелось бы выразить особую признательность всем зарубежным коллегам, приславшим оттиски своих недавних публикаций.
И в заключение, но не в последнюю очередь, я хотел бы от всей души поблагодарить свою жену Раю, такт, мудрость и душевная аура которой, несмотря на все мои недостатки, помогают поддерживать творческую атмосферу в семье. Без всего этого написание книги было бы невозможно.
Неоценимая помощь профессионалов не снимает с меня ответственности за фактическую сторону материала, представленного в монографии. Я буду благодарен за любую конструктивную критику всех спорных интерпретаций генетических фактов, а также замеченных ошибок и неточностей, которые, к сожалению, чаще всего можно увидеть только на расстоянии.
Л.И. Патрушев