III. Экспериментальная гриппозная инфекция у человека

А. ВЛИЯНИЕ ДОЗЫ И ПУТИ ЗАРАЖЕНИЯ

В большинстве исследований, проведенных ранее, заражение вирусом гриппа осуществлялось путем введения через носоглотку аэрозолей, содержащих гетерогенные по размеру частицы, что приводило к инокуляции вируса как в верхние, так и в нижние отделы дыхательных путей. В этих исследованиях лишь с трудом удавалось получать репродукцию вируса при инсталляции его только в носоглотку (Smorodin-tseff et al., 1937; Francis et al., 1944; Henle et al., 1946). Однако в исследованиях, проведенных позднее, было четко показано, что инокуляция вируса в носоглотку приводит к развитию классического синдрома гриппа. Это расхождение молено объяснить по-разному: исследованием лиц, имевших антитела, зависимостью клинической картины от штамма вируса, пассажной истории вируса, дозы и пути заражения. В большинстве экспериментальных исследований в последние годы использовали методы инокуляции вирусом гриппа, noi3-воляющие вируссодержащей суспензии проникнуть в верхние дыхательные пути, а именно закапывание в нос, грубое распыление через нос, глотку или обоими путями (Murphy et al., 1973b; Couch et al., 1974).

Имеются ограниченные данные об инфекционное™ вирусов гриппа для людей при введении их в верхние дыхательные пути, и оценка 50% человеческой инфекционной дозы (ЧИД50) несколько варьирует от штамма к штамму, но при двух определениях она была равна 127 и 320 ТКИД5о для штамма А/Аичи/69 (H3N2) (Couch et al., 1971, 1974). В этих исследованиях в качестве заражающего материала использовали вирус, собранный после второго пассажа в клетках почек эмбриона человека. ЧИД5о варьирует также в зависимости от наличия антител, так что наиболее надежные данные получаются при заражении добровольцев, у которых отсутствуют антитела к NA и НА используемого вируса; раньше такие данные были недоступны в связи с отсутствием специфических методов определения этих антител. Если заражение осуществляется, то значение дозы в интервале от 103 до 109 ТКИД50 невелико и проявляется лишь в сокращении инкубационного периода при использовании больших доз, т. е. тяжесть развивающегося заболевания не зависит от дозы, если заражение осуществилось.

Что касается аэрозольного способа введения вируса, то ранние работы Smorodintseff и соавт. (1937), Burnet и Foy (1940), Francis и соавт. (1944), Henle и соавт. (1943, 1946)

показали, что синдром гриппа может быть надежно воспроизведен на добровольцах при заражении путем вдыхания распыленной аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа. Распыляли большие дозы (от 106 до 1010 эмбриональных или мышиных инфекционных доз), но отсутствуют данные о размерах аэрозольных частиц, месте их оседания в дыхательных .путях, 'количестве вдыхаемого и оседающего ,в дыхательных путях вируса. Несмотря на такие ограничения, исследования этих авторов показали вполне определенно, что у человека можно экспериментально воспроизвести болезнь с субъективными и объективными проявлениями, характерными для триппа яри естественно возникающем заболевании.

Имеются немногочисленные данные о гриппе, возникающем ,в результате введения аэрозолей с известными характеристиками. Введение их также вызывало заболевание, весьма сходное с гриппом, развивающимся при естественном заражении; имеются некоторые данные в отношении инфекци-онности для человека. Alford и соавт. (1966) вводили различные дозы вируса гриппа в виде гомогенного аэрозоля со средним размером частиц 1,5 мим, который задерживался в основном в нижних отделах дыхательных путей. Для вируса гриппа А/Бетезда/10/'63'(Н2Ы2), введенного этим путем, ЧИД5о была оценена как 0,6—3 ТКИД50 на основании опыта, проведенного с 10 добровольцами, имеющими низкое или нулевое содержание в сыворотке нейтрализующих антител к вирусу гриппа. Таким образом, создается впечатление, что нижние отделы дыхательных путей человека в 40—500 раз чувствительнее к вирусу гриппа А, чем верхние дыхательные пути, хотя и не было проведено титрования одного и того же материала при заражении обоими путями. Эти данные подтверждают, что большинство заболеваний в естественных условиях возникает в результате заражения аэрозольным путем.

Обзор данных литературы, относящихся к обоим методам инокуляции, выявляет и другие различия в клинической картине. В большинстве исследований с использованием заражения аэрозолем инкубационный период составлял 12—48 ч, в то время как при инсталляции в носоглотку инкубационный период (был несколько длиннее — от 2 до 3 дней. Опубликованные описания болезни показывают, что симптомы были менее выражены и держались менее длительно при введении вируса в носоглотку. В 2 случаях один и тот же материал вводили двумя путями. Henle и соавт. (1946) вводили три штамма вируса гриппа А и 1 штамм вируса гриппа В добровольцам. Температурная реакция развилась у 58 из 65 получивших вирус путем ингаляции и только у; 2 из

16 добровольцев, получивших 108—109 эмбриональных инфекционных доз того же заражающего материала путем инсталляции в нос. Наоборот, Alford и соавт. '(1966) отметили одинаковую клиническую картину при заражении аэрозолем 1—5 ТКИД50 и при введении в носоглотку от 80 000 до 180 000 ТКИД50, лишь инкубационный период был несколько короче при заражении аэрозолем. Кроме того, весьма вероятно, что симптомы со стороны нижних дыхательных путей, а также кашель менее выражены яри интраназальном заражении. Во всех остальных отношениях клиническая картина была одинаковой. В настоящее время в большинстве случаев заражение добровольцев осуществляется путем введения капель в нос, а не аэрозолем, в основном но соображениям безопасности. Имеется в виду, что вероятность развития поражения нижних дыхательных путей меньше при заражении в нос, нежели при аэрозольном заражении. Вводимые дозы колеблются от 103 до 106, что обеспечивает достаточное количество ЧИД50 для надежного заражения.

Б. ВЛИЯНИЕ ПАССАЖЕЙ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ И НА КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ

Ball и Burnet (1943) первоначально предположили, что в связи с отсутствием у вируса гриппа генетической стабильности пассажи в культуре ткани или на куриных эмбрионах должны вести к получению менее вирулентных штаммов, что является преимуществам в плане получения живых аттенуи-рованных вакцин, но (препятствием к воспроизведению модели инфекции на людях, имитирующей естественное заболевание. Некоторые исследователи отмечали потерю' инфекцион-ноети для человека после двух или четырех пассажей на куриных эмбрионах.Сообщалось (Zhdanov, 1966),что4—8пассажей в курином эмбрионе ведут к снижению вирулентности для человека, а 12—16пассажей—к «полной утрате инфекционно-сти для человека. Число пассажей, ведущих к таким изменениям, может быть определено только в опытах на добровольцах, поскольку не существует каких-либо лабораторных маркеров, которые могли бы быть использованы для такого определения. Другие исследователи не смогли подтвердить эти данные. Веаге и соавт. (1968) работали со штаммом А/Ленин-град/4/65 !(H3N2) и двумя штаммами вируса В, В/Англия/ /13/65 и В/Англия/101/62, каждый из которых 20—30 раз пассировали на куриных эмбрионах; инфекционность и характер заболевания не менялись в результате пассажей. В исследованиях Henle и соавт. (1943, 1946), а также Burnet и Foley (1940) многократно пассированный на эмбрионах материал давал высокую частоту развития заболеваний. Это расхождение может быть результатом иных факторов, чем

история пассирования, а именно таких, как штаммовые различия, доза и .путь 1заражения.

Было показано, что вирусы принта, пассируемые на животных, сохраняют, как правило, вирулентность для человека. В частности, пассажи на хомяках (от 1 до 8 пассажей) и мышах (^15 -пассажей) дают вирулентный заражающий ■материал (Henle et al., 1943, 1946; Burnet et al., 1944), хотя ■конечный материал для заражения в этих опытах обычно готовили «а куриных эмбрионах.

По мнению большинства исследователей, пассажи в культуре -приводят ,к меньшей аттенуации вирулентности для людей и инфекционности, чем пассажи на куриных эмбрионах (Knight et al., 1965). В связи с этим изучение обычно проводят на материале, -прошедшем ограниченное число (пассажей в культурах «леток почек бычьего или человеческого эмбриона (Murphy et al., 1973a; Couch et al., 1974). Культуры клеток почек макак резусов 'непригодны для приготовления заражающего материала в исследованиях на добровольцах, поскольку в этих культурах часто присутствуют .контамини-рующие вирусы.

В. ВЛИЯНИЕ ШТАММОВЫХ РАЗЛИЧИИ

Некоторые упомянутые различия между разными заражающими материалами, (которые не могут быть объяснены ни дозой, ни путем заражения, ни пассажами в культуре ткани или на животных, обусловливаются иногда штаммо-выми различиями. Henle и соавт. (1946) показали, что инкубационный период короче (12—24 ч) при использовании штамма PR8 вируса гриппа А (НОШ) и двух штаммов вируса (гриппа В, чем при использовании штамма F99 вируса гриппа А (H0N1) (36—48 ч). Кроме того, с вирусом F99 наблюдалось обратное соотношение между уровнем антител до заражения и температурной реакцией, чего не 'наблюдалось со штаммами Lee (В) или PR8. Другие исследователи не отметили различий между штаммами, за исключением подвергнутых генетическим манипуляциям (мутация, холодовая адаптация, рекомбинация). Во всяком случае, эти различия незначительны, и характерный клинический синдром не варьирует от штамма к штамму или от года к году.

Г. ДРУГИЕ ФАКТОРЫ

В. М. Жданов и Ритова (1963) отмечают, что проявления заболевания у добровольцев в СССР были более выражены зимой, чем летом, что, видимо, зависело от климатических условий. Наоборот, Веаге и соавт. (1968) в Англии обнаружили сходную картину заболевания у добровольцев, зараженных в период с мая по сентябрь и с октября по апрель.

Д. ОБЪЕКТИВНЫЕ И СУБЪЕКТИВНЫЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Современные данные об экспериментальном гриппе у добровольцев суммированы в та'бл. 48. Как видно из этой таблицы, дозы от 103 до 105 ТКИД5о вызывали заражение в 50— 90% случаев у добровольцев, имеющих низкий или нулевой уровень антител к вирусу, использованному для заражения и 40—70% заразившихся отвечали температурной реакцией, .у 10% развивался афебрильный синдром с респираторными проявлениями, у 27% —бессимптомная инфекция.

Инкубационный период может варьировать от 1 до 3 дней, но, как отмечено ранее, он короче три заражении аэрозолем. Иногда инкубационный период продолжался 3—6 или 7 дней, что отчасти можно объяснить неудачным заражением низкой дозой, интраназальным введением материала и последующей .передачей инфекции от зараженных лиц незараженны-м, т. е. вторичным заражением. Однако в части случаев такой инкубационный период может быть при первичном заражении, ■поскольку он наблюдался у добровольцев, изолированных друг от друга.

Болезнь вполне сходна с той, которая описана при естественно возникающем гриппе. На 61 показано течение заболевания у добровольца, у которого развился типичный синдром гриппа после заражения вирусом гриппа А/Удорн/ /307/72 (H3N2). Начало заболевания было острым— на 2-ю ночь после инокуляции. Субъективные проявления в это время выражались в ощущении жара, ознобе, головной боли, недомогании, миалгиях и утрате аппетита. В некоторых случаях, особенно (После интраназального заражения, слабые продромальные проявления со стороны носоглотки могут развиться за 1—2 дня до появления общих симптомов. Температура достигала максимума в течение 12 ч от начала заболевания, причем максимальная температура варьировала от 38 до 40 °С. Во время ранней фебрильной стадии преобладают общие симптомы. Могут, однако, отмечаться сухой кашель, жидкое прозрачное отделяемое из носа и 'боли в глотке. Лихорадка снижается на 2-й или 3-й день болезни и обычно исчезает на 4-й день, но может продолжаться от 1 до 5 дней. Лихорадка может быть перемежающейся, но обычно бывает постоянной (см. 61); в некоторых случаях наличие второго пика на 3-й или 4-й день болезни приводит к двухфазной температурной кривой. Это особенно часто отмечалось

в ранее проведенных исследованиях (Francis et al., 1944; Henle et al., 1946). По мере того как лихорадка и общие симптомы уменьшаются, возрастает тяжесть респираторных симптомов. Часто кашель начинает сопровождаться выделением небольших количеств 'белой мокроты; характерны заложенность носа, насморк, боли в горле, охриплость. В небольшом проценте случаев наблюдаются тошнота и рвота, но они не являются доминирующими и могут быть обусловлены общей реакцией. Боли в животе и понос не отмечены.

При физикальном обследовании оа ранней стадии заболевания у добровольцев развиваются признаки интоксикации. Кожа лица горячая, влажная, красного цвета, конъюнктива гиперемирована, глаза слезятся, глазные щели сужены. Часто слегка заложен нос, имеется жидкое прозрачное отделяемое из носа. Слизистые оболочки носа и глотки обычно ги-перемированы, но экссудат имеется редко. Малые шейные лимфатические узлы могут пальпироваться, особенно если имеются жалобы на сильные боли ,в торле. Транзиторные рассеянные сухие и влажные хрипы на выдохе возможны, особенно у добровольцев с умеренным кашлем, однако постоянные проявления со стороны органов грудной клетки не обнаруживаются. Респираторные симптомы обычно исчезают на 5—7-й день болезни, хотя кашель может держаться дольше.

В случаях без повышения температуры такие симптомы, как миалгия, головная боль, недомогание, обычно не наблюдаются. В процесс обычно вовлекается либо глотка, причем в этом случае возникают 'боли в горле, гиперемия глотки без экссудата, небольшая реакция шейных лимфатических узлов, либо нос, когда наблюдаются жидкий водянистый секрет, заложенность носа, отек, слизистых оболочек; может встречаться комбинация любых (или всех) описанных выше признаков и симптомов.

У инфицированных добровольцев с бессимптомной инфекцией отсутствуют как субъективные, так и объективные проявления болезни.

Е. ДАННЫЕ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

А. А. Смородинцев и соавт. (1977) сообщили о развитии лейкоцитоза у 7з больных в 1-й день болезни, вслед за которым последовало снижение числа лейкоцитов менее чем до 6-Ю3 в 1 мкл, остававшееся в течение 3—5 дней у 25 из 72 добровольцев, зараженных вирусом А. Это наблюдение было подтверждено и расширено в дальнейших исследованиях. Henle и соавт. (1943) отметили лейкоцитоз (до 15-Ю3 в 1 мкл) в начале болезни, обычно на 2-й день после заражения, обусловленный повышением количества циркулирую-

щих нейтрофилов. Затем общее число лейкоцитов быстро падало, развивалась лейкопения, иногда доходившая до 1,5х Х'Ю3 в 1 .М|1<л и длившаяся от 2 до 4 дней. Относительный лимфоцитоз держится с 4-го по 8-й день. Лейкапения (5-Ю3 в 1 мкл и ниже) шстречалась у лиц, не заболевших, но имеющих повышенный титр антител.

Douglas и соавт. (1966) изучали лейкоцитарную реакцию

у 38 добровольцев, получивших интраназально вирус гриппа

А/Бетезда/10/63 (H2N2). Из 38 добровольцев 21 заболел

спустя 2—4 дня после инокуляции вируса. Инфекция имела

место у 13 из 21 заболевшего и у 14 из 17 незаболевших.

Реакция лейкоцитов в (периферической крови показана на

62. Как видно из рисунка, среди заболевших доброволь

цев нейтрофи.лия имела место на 2-й день после инокуляции

вируса, а на 6-й день наблюдалась нейтропения. Число лим

фоцитов уменьшалось на 1-й день болезни, а у некоторых

добровольцев на 6-й день поднималось выше исходного

уровня. Общее число-лейкоцитов IB начале заболевания пре

вышало 10-ГО3 в 1 мкл (максимум 12-103) у 8 человек из

21 заболевшего и у 2 из 17 незаболевших. Число лейкоцитов

менее 5-Ю3 в 1 м.кл наблюдалось в 'более поздней стадии за

болевания у 3 добровольцев. Эти изменения были статисти

чески достоверными у заболевших; у незаболевших добро

вольцев они 'были недостоверны. Кроме того, отсутствовали

достоверные изменения числа эозинофилов и моноцитов,

а серийное изучение огематодорита и уровня гемоглобина не

выявило изменений. СОЭ была повышена у 50% доброволь

цев.

Изменения числа лимфоцитов, отмеченные до начала заболевания, были также достоверными и зависели от тяжести заболевания. У 12 добровольцев максимальная оральная температура была 38°С и выше, поэтому считалось, что заболевание у них протекает тяжелее, чем у 9 добровольцев, у которых максимальная температура была ниже 38 °С. У тяжелобольных число лимфоцитов нарастало в 1-й день после заражения (средний прирост +540), а на 2-й день резко снижалось (—1100). В более легких случаях число их снижалось в 1-й (—170) и 2-й (—70) день.

Оценка функции печени (SGOT, SGPT, щелочная фоофа-таза, билирубин) и почек (общий анализ мочи, креатинин в сыворотке, азот мочевины) не выявила изменений во время или после болезни.

Ж. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССЕИВАНИЯ ВИРУСА

Вирус гриппа А выделяли из полости носа и рта с помощью разных методов. Ранее чаще всего использовали метод мазков из глотки или носа, а также смывные воды, полученные при полоскании. Позднее стали использовать смывы из полости носа. Couch и Douglas, Jr. (неопубликованные данные) сравнивали смывы из полости носа, мазки из глотки, мокроту, секрет слизистой оболочки рта и мазки из носа, которые собирали ежедневно у 6 добровольцев, зараженных интраназально вирусом гриппа А/Гонконг/68 (H3N2) (63). Смывы из полости носа давали наиболее постоянные положительные результаты. Эти пробы использовали для большей части количественных исследований. Преимущество их обусловлено скорее всего тем, что с помощью этой процедуры можно получить 1 мл секрета из носовых ходов и задней части глотки, тогда как с помощью мазков материал получают с ограниченного пространства и в количестве не -более 0,15 мл. Однако преимущества этого способа в определении ранней репликации вируса в носоглотке проявляются лишь в первые 2 дня после заражения. Мокроту труднее собирать у добровольцев, не страдающих кашлем, поскольку для этого необходима ингаляция изотоническим раствором хлорида натрия или веществами, вызывающими отделение мокроты; секрет слизистой оболочки полости рта, помимо того, что содержит малое количество вируса, относительно токсичен для тканевых культур.

Как показано на 64, количественное определение вируса в смывах из носа путем титрования на культуре клеток почек макак резусов дает характерную картину. Вирус определяется в умеренных количествах на 1-й день после инокуляции, затем его количество быстро нарастает, достигая пика 3,0—7,0 lg, ТКИД50/МЛ на 2-й день, и несколько медленнее снижается. Вирус не определяется приблизительно через 5— 10 дней после заражения. Как показано на 61, имеется близкая корреляция между заболеванием и количеством выделяемого больным вируса. Было установлено определенное соотношение между степенью репликации вируса и тяжестью заболевания. Couch и соавт. (1971) показали значительную положительную корреляцию между количеством вируса и тяжестью заболевания.

Кроме того, Murphy и соавт. (1973а) показали наличие корреляции между максимальным титром вируса, определяемым в смывах из носа, и лихорадкой, т. е. объективной оценкой заболевания, включающей степень и длительность повышения температуры.

Stanley и Jackson (1966) сообщили о виремии при гриппе, вызванном у добровольцев штаммам А/Бетезда/10/63'(!Н2М2), но публикации, подтверждающие эти данные, отсутствуют. Одиннадцать из 23 гароб темолизированной крови, собранной во время инкубационного периода, содержали вирус гриппа, что обнаруживалось при заражении куриных эмбрионов. Виремия начиналась приблизительно за день до появления вируса в носоглотке и за 2 дня до развития симптомов заболевания. Доказательством происхождения выделенных вирусов от человека служило повторное выделение его из исходных проб, а заражение добровольцев было подтверждено серологически. Выделенные штаммы были идентифицированы как вирус гриппа А, обладающий свойствами, идентичными свойствам использованного для заражения штамма.