Рибонуклеиновые кислоты вирусов гриппа

М. В. ЛОНС (М. W. PONS)

I. Введение

Вирус гриппа имеет уникальный по сравнению с другими вирусами животных спектр биологических свойств. Он обладает способностью .к множественной реактивации (Hoyle, Liu, 1951), образованию неполных вирусных частиц (von Magnus, 1954), чувствителен к антиномицину D (Barry et al., 1962), его нуклеиновая кислота неинфекционна -и он обладает способностью к генетической рекомбинации (Simpson, Hirst, 1961; Hirst, 1962). Это последнее свойство .позволило высказать предположение, что геном вируса гриппа состоит из двух или большего числа фрагментов однонитчатой рибонуклеиновой кислоты (РНК), а не из одной цепочки ковалентно связанных нуклеотидов (Burnet, 1956; Hirst, 1962). Впоследствии эта биологическая гипотеза была подтверждена биохимическим анализом РНК, изолированной из внр'ионов (Duesberg, 1968; Pons, Hirst, 1968а), л тем фактом, что внутриклеточная репликативная форма вирионной РНК также существует в виде отдельных фрагментов (Pons. Hirst, 1968).

Рибонуклеиновая кислота вируса гриппа составляет 0,8— 1,1% сухой массы вирусной частицы (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956; Frommhagen et al., 1959). Химический анализ РНК, изолированной из очищенных ви-рионов, позволил оценить массу РНК 2-Ю6—3-Ю6, содержащейся в одной вирусной частице (Ada, Perry, 1954; Frisch-Niggemeyer, Hoyle, 1956). Полученная величина, однако, является 'без сомнения слишком малой. Хотя она и достаточно близка к общепринятой величине 4,5- 10s—5-Ю6 РНК «а один вирион, слишком малое процентное содержание РНК в вирионе гриппа, .а также (или) присутствие в вирусной популяции неполных вирусов могут явиться причиной заниженной оценки количества РНК, входящей в состав одной вирусной частицы (см. раздел ШВ).

II. Методы

А. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА ВИРУСОВ ГРИППА

Существует несколько различных методов очистки вирусов гриппа. Описанный здесь метод постоянно используется в нашей лаборатории, а также, с небольшими модификациями, в некоторых других научных группах. Метод одинаково пригоден для очистш вируса, культивированного как на куриных эмбрионах, так ,и на монослойной культуре фибро-бластов куриного эмбриона (CEF). Кроме того, с помощью этого метода получают препараты вируса высокой степени чистоты с 40% выходом относительно исходного количества вирионов при очень небольшой .потере инфекционное™ и ге-магглютинирующей активности. В .настоящее время описаны и другие методы очистки (в 'частности, с использованием для осаждения сульфата аммония), с помощью которых также получают вирусные препараты высокой чистоты, однако высокая 'концентрация соли, используемая в этих методах, оказывает нежелательное действие на инфекционность вирионов. Необходимо отметить, что основное требование, предъявляемое к описанным здесь -методикам, состояло в минимальном воздействии на инфекционность вируса.

В большинстве биохимических работ, выполненных на вирусах гриппа США, в качестве объекта исследования использовали штамм WSN. В Европе же внимание сосредоточилось на изучении FPV, другого штамма вируса гриппа А. Различия между этими двумя штаммами (в частности, в нуклеиновых кислотах и их репликации), вероятно, не особенно велики.

Штамм WSN обычно культивируется на первичной культуре фнбробластов куриных эмбрионов (CEF). Для получения больших количеств вируса [порядка 5-Ю10—10-Ю10 бляшкообразующих единиц (БОЕ)] 40—60 сплошных монослоев инокулируютея с вирусом с множественностью заражения приблизительно 5-Ю""5 БОЕ на клетку. Монослои инкубируют при 37 °С в течение 40 ч в атмосфере 5% СО2 (Simpson, Hirst, 1961), и вирус выделяют из сулернатанта по методике, описанной далее. Для получения радиоактивно меченного вируса в систему непосредственно перед инкубацией при 37 °С добавляют нужные изотопы, обычно [3Н]-5-уридин (2— 5 М'кК!и/мл) или [3Н]-или,[14С]-аминокислоты (2—4мкКи/мл).

После обработки РНК-азой вирус наслаивают поверх 4 мл 30% сахарозы в буфере STE и центрифугируют в течение 1 ч при 145 000 g. К осадку добавляют буфер STE, смесь гомогенизируют для того, чтобы полностью ресуслендировать вирус, и центрифугируют для удаления дебриса на малой скорости. Сулернатант наслаивают на линейный градиент сахарозы (по 10 мл 30—60% сахарозы в буфере STE), покрытый слоем минерального масла (10 мл) и центрифугируют до равновесия в течение 17 ч при 96 000 g. Видимый визуально слой вируса обнаруживают в области плотностей 1,18—1,19 г/см3 и отбирают по фракциям (1 мл), начиная со дна пробирки. Сахарозу удаляют из вирусной суспензии либо хроматографией через сефадекс Г-50, либо с помощью осаждения вируса центрифугированием в течение 60 мин при 145 000 g и ресуспендирования осадка в буфере STE.

Б. ЭКСТРАКЦИЯ ВИРИОННОЙ РНК