II. Реакция гемагглютинации

А. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ РЕЦЕПТОРА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

Вирусы гриппа агглютинируют эритроциты за счет взаимодействия с гликопротеидом, в состав которого входит сиаловая кислота и который является компонентом мембраны эритроцитов. Этот вирусный рецептор был изолирован из стромы эритроцитов человека, а химический состав я физические свойства его были подробно изучены Winzler и соавт. (1969а). Рецептор является гликопротеидом, содержащим М-и N-групповые антигены крови (Kathan, Winzler, 1963; Моrawiecki, 1964; Kathan, Adamany, 1967). Рецептор, изолированный из клетки, является высокоэффективным ингибитором гемагглютинирующей активности вируса гриппа.

В табл. 8 приведены свойства изолированного рецептора и сиалогликопептида, отщепляемого от N-конца молекулы рецептора с помощью трипсина. Отщепляемый гликопептид не обладает ингибирующей активностью, хотя он и содержит большую часть сиаловой кислоты, гексозы и гексозамина, входящих в состав нерасщепленного вирусного рецептора (Winzler et al., 1967). Лолипептидная часть рецептора составляет только около 18% его массы. Почти половина аминокислотных остатков представлена сер ином и треонином. Углеводные цепочки присоединяются к этим двум аминокислотам с помощью О-гликозидной связи. С аспарагином они связаны N-гликозидной связью. Остатки сиаловой кислоты занимают в углеводных цепочках концевое положение и могут быть отщеплены от рецептора с помощью вирусной нейраминидазы (Kathan, Winzler, 1963). Отщепление сиаловой кислоты от молекул рецептора приводит к подавлению их способности ингибировать гемагглютинацию и способности являться М- и iN-групповыми факторами крови (Springer, An-sell, 1958). В случае отсутствия в среде детергентов наблюдается агрегация интактных молекул с образованием агрегатных форм с молекулярной массой около 590000. Ингибиторная активность, а также М- и N-групповая активность , крови увеличивается при агрегации (Springer, 1967). Предполагается, что склонность к агрегации объясняется гидрофобной природой карбоксильного конца рецептора. С помощью обработки трипсином (Winzler, 1969a) и цианидом брома (Маrchesi et al., 1972) от С-конца может быть отщеплен полипептид, в состав которого входят в основном гидрофобные аминокислотные останки и который нерастворим в водной фазе. Winzler (1969а, Ь) предположил, что вирусные рецепторы присоединяются к мембране эритроцитов с помощью гидрофобных областей карбоксильных концов и что сиалопептиды, расположенные на N-концах, локализуются в водной фазе, окружающей эритроцит, где они могут вступать во взаимодействие с вирусом гриппа, антителами против М- и N-анти-генов и трипсином. Определив количество молекул сиаловой кислоты, отщепляемой от эритроцитов при обработке трипсином, Winzler подсчитал, что каждый человеческий эритроцит содержит на своей поверхности около 106 молекул сиалопептида. Однако число рецепторных точек эритроцита, вероятно, меньше числа молекул рецептора.

Howe и соавт. (1970) обнаружили, что меченные ферритином антитела к очищенному рецептору не распределяются равномерно по поверхности интактных клеток, а присоединяют ся только к дискретным областям. Таким образом, рецепторные молекулы, вероятно, группируются в своеобразные «кластеры», формируя на поверхности эритроцитов области, связывающие вирус.

Б. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ ГРИППА С ЭРИТРОЦИТАМИ

Присутствие сиаловых кислот на поверхности эритроцитов, по-видимому, является необходимым условием адсорбции на них вирусов гриппа, поскольку полное удаление их приводит к тому, что эритроциты становятся неспособными к агглютинации (Hirst, 1950). Вирусные частицы также теряют способность связываться с искусственными мембранами, образованными фосфатидилхолином и гликопротеидами, если отщепить от их гликопротеидной части сиаловую кислоту (Tiffani, Blough, 1971). Количество сиаловой кислоты, необходимой для связывания, однако, варьирует в разных штаммах. Вирионы различных штаммов могут быть построены в определенные ряды по своей способности агглютинировать эритроциты, с которых были элюированы вирионы других штаммов (Burnet et al., 1946).

Определяющая роль остатков сиаловой кислоты в процессе присоединения вирионов к эритроцитам была показана в экспериментах, проведенных Suttajit и Winzler (1971). От полигидроксильных боковых цепочек остатков сиаловой кислоты в гликопротеидах могут быть отщеплены один или два атома углерода с помощью мягкого периодатного окисления с последующим восстановлением с помощью бортидрида натрия. Полученные таким способом модифицированные гликопротеиды обладают резко сниженной способностью к ингибированию гемагглютинации. Метилирование карбоксильной группы сиаловой кислоты также снижает ингибиторные свойства глнкопротеида (Kilbourne et al., 1972). Таким образом, на адсорбцию вируса на эритроцитах, вероятно, влияют как зарядовые, так и общие конфигурационные свойства рецепторного гликопротеида.

В некоторых видах эритроцитов в процессе адсорбции вирионов участвуют содержащие сиаловую кислоту вирусные рецепторы, отличающиеся от описанных рецепторных гликопротеидов. По данным Winzler (1969a), вирусы гриппа сохраняют способность агглютинировать человеческие эритроциты, из которых сиалопептиды удаляют с помощью обработки трипсином. Поскольку известно, что липосомы, содержащие ганглиозиды, могут связывать один из парамиксовирусов — вирус Сендай (Haywood, 1974), вполне вероятно, что именно сиализидированные гликолипиды, находящиеся на поверхности эритроцитов, могут быть причиной адсорбции вирионов гриппа. Haywood предположила, что рецепторные центры могут не содержать гликопротеидов, если в их состав входят ганглиозиды. Она считает, что эти гликолипиды при соответствующей их ориентации на мембране эритроцита могут создать упорядоченный слой молекул сиаловой кислоты, необходимый для вирусрецепторной активности. Однако свободная сиаловая кислота, свободные ганглиозиды и небольшие углеводы, содержащие сиаловую кислоту, не ингибируют гемагглютинацию (Hughes, 1973; Haywood, 1974).

В настоящее время имеется еще одно доказательство того, что молекулы, не содержащие в своем составе остатков сиаловых кислот могут играть роль в адсорбции вирусных частиц на эритроцитах. Некоторые штаммы вируса гриппа не элюируют с эритроцитов, хотя и отщепляют сиаловую кислоту от клеток, на которых они были адсорбированы (Tsvetkova, Lipkind, 1966), и, наоборот, вирусы могут элюировать с некоторых клеток при отсутствии регистрируемого отщепления сиаловой кислоты (Tamm, 1954). В то время как процесс связывания определяется только содержанием сиаловой кислоты в рецепторах, скорость элюции вируса должна определяться величиной нейраминидазной активности вирусной частицы. Это не всегда так (Choppin, Tamm, 1959, 1960; Tsvetkova, Lipkind, 1966).

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что для агглютинации, помимо взаимодействия клеточных рецепторов с остатками сиаловой кислоты, требуется еще и взаимодействие их с компонентами клеточной мембраны. Степень взаимодействия вирусов и эритроцитов, вероятно, зависит как от общей архитектоники связывающих клеточных центров, так и от структуры вирусного гемагглютинина. Таким образом, достаточным условием гемагглютинации, по всей видимости, является вхождение в состав данного центра необходимого числа остатков сиаловой кислоты, а также наличие структурной комплементарности между клеточной мембраной и вирусным гемагглютинином (Fazekas de St. Groth, Gottschalk, 1963; Springer et al., 1969).

В. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСОВ И АНТИТЕЛ, ОСНОВАННЫЕ НА ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ