1. Количественное определение гемагглютинации

В связи с большим числом рецепторных молекул на поверхности эритроцита к каждой эритроцитарной клетке может присоединиться большое число частиц вируса гриппа. Было подсчитано, что один эритроцит морокой свинки может адсорбировать на своей поверхности около 7000 вирусных частиц (Bateman et al., 1955). Однако, если в системе существует ограниченное число вирионов, вирусные частицы и эритроциты образуют агрегаты, в которых оба участника реакции присутствуют в соотношении 1—20 вирусных частиц на один эритроцит (Tyrrell, Valentine, 1957; Seto et al., 1961; Hoyle, 1968).

Степень гемагглютинации, наблюдаемая с данным количеством вируса, зависит от типа эритроцитов, штамма вируса, а также от температуры, рН и ионного состава среды. Тип используемых эритроцитных клеток является главным фактором, определяющим наличие или отсутствие гемагглютинации. В реакции могут быть использованы эритроциты позвоночных животных — птиц, амфибий и млекопитающих (Hoyle, 1968). Степень агглютинации клеток и количество вируса, которое они способны адсорбировать, варьирует в зависимости от вида, к которому принадлежит животное, и индивидуального представителя данного вида.

Вирусные частицы также различаются по своей способности вызывать гемагглютинацию. Таким образом, количественное описание реакции гемагглютинации зависит от наличия детальных сведений о всех компонентах используемой системы. Например, вирионы вновь изолированных штаммов гриппа (т. е. штаммы, которые прошли только несколько пассажей в лаборатории) часто имеют филаментозную форму, в то время как форма вирионов широко используемых лабораторных штаммов обычно сферическая. Вирусные частицы филаментозной формы могут теоретически агглютинировать большее число эритроцитов; таким образом, степень наблюдаемой агглютинации не обязательно отражает количество присутствующих в системе вирусных частиц.

Для всех вирусных штаммов наблюдаемая степень агглютинации зависит от двух противоположных реакций — адсорбции и элюции. Поскольку для адсорбции необходимы столкновения между эритроцитами и вирусными частицами, скорость этой реакции определяется концентрацией реагентов и почти не зависит от температуры. С другой стороны, элюция обычно представляет результат ферментной деструкции и поэтому является температурозависимым процессом. Вирусные штаммы, обладающие низкой нейраминидазной активностью, могут быть обнаружены по реакции гемагглютинации при 20 °С. Для штаммов же с высокой активностью нейраминидазы скорость элюции при 20 °С может быть достаточно высока, так что агглютинация может и не наблюдаться. Эффект агглютинации для таких вирусов может обнаруживаться -при 4°С или при 20 °С после деструкции вирионной нейраминидазы с (помощью мягкой тепловой обработки (Hirst, 1948b; Stone, 1949).

Разработано большое число различных методик для обнаружения гемагглютинации, индуцируемой вирусными частицами. Обычно кратные разбавления вируса инкубируют совместно со стандартной суспензией эритроцитов и наличие гемагглютинации выявляют визуально (Salk, 1944) либо с помощью денситометрии. В последнем случае спектрофотометрические измерения смеси вирусов с эритроцитами проводят после стандартного периода инкубации для формирования осадка (Hirst, Pickels, 1942; Levine et al., 1953; Horsfall,1954; Drescher, 1957). Совсем недавно разработана методика, согласно которой агглютинацию выявляют количественно с помощью определения количества гемоглобина, высвобождаемого из эритроцитов, не подвергшихся агглютинации данным разведением вируса (Cohen, Belyavin, 1966). Количество гемоглобина определяли и регистрировали с помощью автоматического анализатора. Кроме того, разработаны методики определения концентрации субъединиц гемагглютинина (Drescher, 1966, 1967).

Из всех описанных методик наиболее часто применяют прямое визуальное определение конечной точки титрования по картине агглютинации. При этом обычно используют эритроциты цыпленка и кратные двойные разведения в пробирках или в лунках пластмассовых пластин (при этом реакция может быть проведена в микрообъеме). Когда необходимо провести более точное определение, либо используют метод кратных разведений, разработанный Horsfall и Tamm (1953), либо определяют конечную точку агглютинации с помощью денситометра. Стандартная ошибка конечного вирусного титра, определенного методом кратных разведений, составляет примерно 17% (Horsfall, Tamm, 1953). Drescher (1957) показал, что при использовании спектрофотометрической методики ошибка составляет 3%.