5. Гемагглютинин

Гемагглютинин синтезируется как большой гликопроте-ин — предшественник НА, который впоследствии расщепляется на два меньших гликопротеина: HAi и НА2 '(Lazarowitz «t al., 1971). Расщепление, которое можно подавить ингибиторами протеаз (Klenk, Rott, 1973), осуществляется, по-видимому, протеолитическими ферментами клетки-хозяина (Lazarowitz et al., 1973). Степень расщепления зависит от штамма вируса, клетки-хозяина, уровня цитоиатического эффекта и присутствия или отсутствия в среде сыворотки (Lazarowitz et al., 1971, 1973а, b; Klenk, Rott, 1973; Stanley et al., 1973). Так, ВЧП, выращенный в культуре фибробластов куриного эмбриона, содержит только расщепленные глишпротеины ге-магглютннина, тогда как такое расщепление фактически отсутствует, если выращивать вирионы WSN в клетках MDBK в отсутствие сыворотки. В присутствии сыворотки, однако, гемагглютинин WSN также расщепляется. Расщепление в этой

системе имеет место на .плазматической мембране (Lazaro-witz et al., 1973a). В системе ВЧПмеханизм такого расщепления, по-видимому, другой. Расщепление «происходит .на внутриклеточных мембранах, и плазминоген в этом случае не является необходимым (Щепк et al., 1974a). Степень расщепления резко уменьшается три 25 °С (Klenk, Rott, 1973).

Расщепление НА не является необходимым условием для гемагглютинирующей активности и для сборки вириона (La-zarowitz et al., 1973a; Stanley et al., 1973), но исследования,, проведенные недавно, 'обнаружили, что оно необходимо для инфекционности (Klenk et al., 1975b). Эти данные согласуются с гипотезой о том, что, помимо своей роли в адсорбции, НА* имеет и другую функцию в инфекционном процессе и что расщепление необходимо для этой функции. На основании того, что расщепление НА является феноменом, зависящим от «летки-хозяина, и что частицы, содержащие нерасщеплен-ный НА, обладают низкой инфакционностью, предполагают зависимость диапазона хозяев и распространения инфекции вируса гриппа от присутствия протеазы клетки-хозяина как. активирующего фермента.

В опытах по фракционированию «леток, зараженных ви

русом гриппа, обнаружено,, что гликопротеины НА всегда ас

социированы с мембранами (Compans, 1973a; Klenk et al.,.

1974а). Внутриклеточная локализация этих белков ж их миг

рация от шероховатых мембран к гладким эндоллазматиче-

ского ретикулума и к плазматическим мембранам будут де

тально описаны в разделе VII, В. . .,

6. Нейраминидаза

Вирусная NA* как активный фермент была обнаружена,

через 3 ч после инфекции в хорион-аллантоиеных мембра

нах, и путем экстраполяции установлено, что начало ее син

теза приходится на 1—2-е часы после заражения (Noll et al.,

1961). Внутриклеточную локализацию NA* исследовали пу

тем фракционирования клеток, и нашли, что она, по-видимо

му, подобна локализации НА* (Compans, 1973a; Klenk et al.,,

1974а). NA* была обнаружена в ассоциации с мембранами,

полученными из гладкого эндоплазматичеекого ретикулума,

при определении ее по биологической активности и по анали

зу в полйажриламидном геле. Активность фермента была най

дена также во фракциях, содержащих шероховатые мембра

ны. Эти данные согласуются с данными, полученными при

иммунофлюорееценции (Maeno, Kilbourne, 1970). Через 4 ч

после заражения яейраминидазу можно обнаружить в цито

плазме; позже она, по-видимому, концентрируется на пери

ферия клетки.

V. СИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ

Углеводы участвуют в образовании гликопротеинов и гли-колилидов оболочки вируса гриппа (Klenk et al., 1972a). Гли-колипиды миксовирусов (происходят из плазматических мембран клетки-хозяина (Klenk, Choppin, 1970), «о не было определено, что преимущественно (включается в вирион: уже существовавшие или вновь синтезированные гликолипиды.

Использование радиоактивных предшественников, таких, как глюкозамин, манноза, галактоза и фукоза, которые специфически включаются в вирусные глмкопелтиды, показало, что углеводные боковые цепи этих гликопептидов вновь синтезируются в процессе инфекции (Haslam et al., 1970; Corn-pans et al., 1970a; Schwarz, Klenk, 1974). Опыты по фракционированию (клеток дали дополнительную информацию о местах гликозилирования вирусных гликопротеинав. Глюкозамин ассоциирован с НА-полипептидом во фракциях как гладких, так и шероховатых цитоплаэматических мембран; однако фукоза ассоциирована с НА в гладких, но не в шероховатых мембранах (Compans, 1973b). .Подавление белкового синтеза пуромицином почти незамедлительно останавливает включение глюкозамина, в то время как фукоза еще продолжает включаться в течение примерно 10—15 мин (Stanley et al., 1973). Наконец у FPV гликопротеид — предшественник НА и продукты расщепления HAj <и НА2 содержат, по-видимому, полный состав маннозы « глюкозамина, тогда как содержание фукозы и галактозы значительно выше в продуктах расщепления (Klenk et al., 1975a; Schwarz, Klenk, 1974). Эта наблюдения предполагают, что биосинтез углеводных боковых целей гликопротеинов НА осуществляется по стадиям с различными остатками Сахаров, добавляемыми в разных участках клетки. Глюкозамин и манноза (присоединяются, по-видимому, к полипептидам НА на шероховатых мембранах вскоре после или даже в процессе синтеза поляпептида, в то время как фукоза, вероятно, прикрепляется позже с помощью трансфераз, присутствующих в гладких мембранах.

Эти гликозилтрансферазы являются, вероятно, ферментами клетки. Следовательно, углеводная (часть гликопротеидов определяется, по-видимому, клежой-хозяином. Имеются, однако, свидетельства того, что в дополнение к этим ферментам клетки-хозяина существенную роль в образовании углеводных боковых цепей играет вирусная NA*. Установлено, что поверхность оболочек микеовирусов лишена нейраминовой кислоты (Klenk, Choppin, 1970b; Klenk et al., 1970), в то время как в вирусных оболочках, которые не содержат этого фермента, такой углевод является обычной составной частью (Klenk, Choppin, 1971; McSharry, Wagner, 1971; Renkonen et al., 1971). Эти данные позволяют предположить, что отеут-

ствие нейраминовой кислоты является существенной особенностью миксовирусов. Недавно удалось показать, что NA* ответственна за удаление нейраминовой кислоты из оболочки вируса гриппа, предотвращая тем самым образование на вирусной оболочке (рецепторов, которые в противном случае приводили оы к образованию больших агрегатов вирусных частиц (Palese et al., 1974). Эти данные поддерживают концепцию, что углеводная часть НА* как основного поверхностного гликопротеина является продуктом •комбинированного действия (Клеточных транефераз и вирусной NA*. Благодаря ее действию вирус способен вводить вирус-специфическую модификацию в (Первоначально специфичную для хозяина, сложную структуру углевода—модификацию, которая, по-видимому, существенна для -биологической активности вируса.

D-глюкозамин и 2-дезокси-0-глк>коза ингибируют образование биологически активного НА*, NA* и инфекционного вируса (Kilbourne, 1959; Kaluza et al., 1972). Биохимические исследования выявили, что эти сахара .конкурируют с биосинтезом вирусных гликоггротеинов (Ghandi et al., 1972; Klenk et al., 1972b). В присутствии этих ингибиторов размер глигко-пр'отеидов НА уменьшается. Степень уменьшения зависит от дозы. Так, при увеличении концентр!ации сахара гликопроте-пд НА с относительной молекулярной массой 76 000 постепенно превращается в соединение с молекулярной массой 64 000, которое было обозначено как HA0 (Klenk et al., 1972b; Schwarz, Klenk, 1974). Сдвиг молекулярной массы параллелен уменьшению содержания углеводов и, как -было установлено, белок HA0 почти свободен от углеводов (Schwarz, Klenk, 1974). Эти результаты показывают, что HA0 является не полностью гликозилированной или «егликозилированной полипептидной цепью гликопротеина НА и что «нгибирующее действие D--глюкоз амин а и 2-дезокси-0-глюкозы осуществляется благодаря повреждению гликозилирован-ия. Полипептид HA0 ассоциирован -с мембранами, как -и нормальный НА. Он также мигрирует от шероховатого к гладкому эядопла-з-■матичеокому ретикулуму, где расщепляется на полипептиды НА01 и НА02. Следовательно, углеводы, -вероятно, несущественны для сродства этого полипептида к мембране. Однако отсутствие гемагглютинирующей активности в зараженных клетках предполагает, что негликоз-илированный белок не способен связываться с рецепторами.