2. Нейраминидаза

В работе, в которой из различных штаммов вируса гриппа изолировали поверхностные «шипы» гемагглютинина (La-ver, Valentine, 1969), кроме того, выделяли структуры отличной морфологии, обладающие нейраминидазной активностью. Это наблюдение подтвердило мнение о том, что на поверхности вирионов гриппа имеются два различных типа «шипов». «Шипы» нейраминидазы имели продолговатую головку размером приблизительно 5x8,5 нм, присоединенную к нитевидной ножке длиной около 10 нм, на конце которой имелось небольшое утолщение диаметром 4 нм. В отсутствие детергента эти структуры слипались своими концами, образуя розетки. Следовательно, в их составе также имеются гидрофобные области. Хотя из вирионов с помощью детергентов и изолировали два различных типа поверхностных структур, их не удалось до настоящего времени различить на поверхности необработанных вирусных частиц, что, вероятно, объясняется их близким расположением в вирусной оболочке. Это может быть также обусловлено трудностью идентификации «шипов» нейраминидазы на фоне большого числа поверхностных структур гемагглютинина.

Как было уже оказано, молекулярная масса мономерной субъединицы NA лежит в пределах 55000—65 000. Имеются биохимические и морфологические аргументы в пользу того,

что нейраминидазный «шип» представляет сооои тетрамер с молекулярной массой 200 000—250 000 (Kandal, Eckert,. 1972; Bucher, Kilbourne, 1972; Lazdins et al., 1972; Wrigley i'.t al.. 1973). Электронно-микроскопические .исследования нейраминидазы после ее обработки трипсином выявили структуры, состоящие из четырех сфер диаметром 4 нм, сгруппированных в квадратную компланарную структуру (Wrigley et al., 1973). Такого рода тетрамер на виде сбоку соответствует вытянутой головке нейраминидазного «шипа»,, изолированного с помощью детергента. С помощью обработки трипсином разрушалась стеблеобразная нить субъединицы нейраминидазы.

Так же как в случае гемагглютинина, механизм присоединения нейраминидазы к вирусной мембране не совсем ясен. Вероятно, подобно «шипу» гемагглютинина, «шип» нейраминидазы имеет гидрофобную область, которая вовлечена в это взаимодействие и при определенных условиях подвержена действию протеазы.

В. ДВОЙНОЙ ЛИПИДНЫЙ СЛОЙ

В связи с тем что вирионы гриппа образуются в процессе отпочкования от плазменных мембран, причем вирусные частицы получают свои липиды именно от этих клеточных ор-ганелл, вполне вероятно, что организация липидов в вирусной оболочке зеркально отображает организацию липидного слоя плазменных мембран клетки. Имеющиеся в настоящее время данные указывают на то, что -вирусные липиды организованы в структуру, представляющую собой двойной ли-пидный слой. Исследования, проведенные с помощью метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) при использовании спин-меченных производных стеариновых кислот, показали, что в вирионах гриппа имеется именно двухслойная структура липидов (Landsberger et al., 1971, 1973). Градиент подвижности спиновых зондов, характерный для структур тина двойного слоя (McConnell, McFarland, 1972), наблюдался также и в случае спин-меченных вирионов гриппа. Если 'спиновый зонд, содержащий нитроксидное ядро, был прикреплен близко к полярному концу молекулы стеариновой кислоты, он находился в вирионе в области с относительно высокой степенью упорядоченности липидного слоя. Если же эта группа находилась относительно далеко от .карбоксильного конца молекулы стеариновой кислоты, то ее окружение более приближалось к жидкофазному состоянию. На 9 приведены спектры ЭПР вирионов гриппа с включенными в них спин-меченными стеариновыми кислотами и спектры эритроцитов человека, полученные в аналогичных условиях; в случае обеих мембран спектры очень сходны.

На основании экспериментов, проведенных с соединением, которым метили поверхностные структуры, был сделан вывод, что структура фосфолипидов поверхностных мембран -клетки асимметрична, причем холинсодержащие молекулы в основ-н:>м сосредоточены во внешней части двойного слоя, в то вре-VR как аминофосфолипиды расположены в его внутренней части (Bretscher, 1972, 1973). Свойствен ли такой тип структуры вирусной оболочке, пока не ясно, однако существующие г настоящее время данные об организации липидной оболоч-УМ ларагриппозных вирусов (Klenk, Choppin, 1969, 1970а) не согласуются с утверждением о том, что фосфатидилэтанол-iMira и фосфатидилсерин всегда расположены на внутренней части двойного липидного слоя, а фосфатидилхолин — на его внешней части. Отношение количества аэдинофосфолипидов к количеству холинсодержащих фосфолипидов варьирует в ши-z эких пределах для вирусов, выращенных на «летках различных типов, и это отношение коррелирует с аналогичной величиной для клеток-хозяев. В связи с тем, что все исследованные вирусы парагриппа содержали в 'поверхностном слое одинаковые белки, утверждение о возможном вытеснении ли-пидов из части 'биелоя за счет внедрения туда белковых молекул (Bretscher, 1973), не согласуется с наличием различий з фосфолипидном составе. В связи с этим возможно, что разное соотношение липидов отражает различное распределение индивидуальных фосфолипидных молекул во внутренней и внешней частях двойного липидного слоя.

В ультратонких срезах вирион гриппа имеет характерную мембранную структуру, морфологически сходную со структу-эой поверхностной клеточной мембраны «летки-хозяина (см. 6—8). Внешний вид вирусной оболочки зависит как от вида клеток, на которых вирус выращивали, так и от вида электронно-микроскопического контрастирования (Compans, Dimmock, 1969). Если на поверхности клетки удается обнаружить элементарную мембрану, в вирусной частице наблюдается мембрана аналогичного вида. Внешний слой вирусной мембраны покрыт поверхностными «шипами», а на внутренней поверхности был обнаружен дополнительный слой с высокой электронной плотностью, который не обнаруживается в нормальной клеточной мембране. Как будет показано далее, вполне вероятно, что этот слой соответствует локализации на внутренней поверхности двойного липидного слоя молекул М-белка.

Распределение контрастного вещества после фиксации мембран осмием, вероятно, отражает локализацию амннофос-фолипидов (Bretscher, 1973). При фиксации и контрастировании осмием отчетливо окрашиваются как внутренний, так и внешний слои листка элементарной мем-браны клеток MDBK, в то время как в клетках BHK21-F или клетках куриных фибробластов окрашивается только цитоплазматический слой. Окраска внешнего слоя вирионов гриппа, выращенных на «летках MDBK, коррелирует с более высоким содержанием аминофоофолипидов в этих клетках (Klenk, Choppin, 1970а) и возможно, что в этих условиях аминофосф'Олипиды распределены на обеих сторонах двойного слоя, в то время ка,к они отсутствуют на внутренней поверхности липидного слоя клеток BHK21-F.

В вмрионах гриппа обнаруживаются также гликолипиды, причем их локализацию на внешней 'поверхности двойного липидного слоя продемонстрировали агглютинацией вирионов с помощью специфических лектинов (Klenk et al., 1972а).

В интактных вирионах гликолипиды закрыты, но становятся доступными для лектинов после удаления поверхностных «шипов» с ломощью обработки протеазой.

Г. МЕМБРАННЫЙ БЕЛОК

Как уже было указано, при изучении с помощью электронного микроскопа окрашенных ультратонких срезов вирионов гриппа на внутренней поверхности вирусной оболочки наблюдается дополнительный слой с высокой электронной плотностью (см. 7 и 8). Этот слой не обнаруживается в нормальных цитсшлазматических мембранах (Apostolov, Flewett, 1969; Kendal et al., 1969; Compans, Dimmock, 1969; Bachi et al., 1969; Apostolov et al., 1970). В настоящее время существует несколько независимых групп аргументов в пользу того, что этот слой образован самым низкомолекулярным и наиболее широко представленным белком вириона, называемым мембранным, или матриксным, белком (М-белок). Доказательства эти следующие: 1) гликопротеиновые «шипы» могут быть удалены с помощью протеолитических ферментов при сохранении М-белка и слоя с высокой электронной плотностью (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970, 1972; Kendal et al., 1969). После такой обработки кроме М-белка в составе вириона^, остаются только белок NP и Р-белки, и ни один из них не может быть ответствен за наличие слоя с высокой электронной плотностью. Несколько адолекул Р-белков, присутствующих в вирионе, не могут образовать такой слой, а белок NP находится во внутренней части вириона, входя в состав спирального нуклеокапсида; 2) расчеты показывают, что только М-белок присутствует в вирионе в (количестве, достаточном для формирования непрерывной оболочки толщиной 4—6 нм под двойным лиошдньш слоем (Compans et al., 1972; Schulze, 1972); 3) после экстракции липидов из фиксированных, лишенных поверхностных «шипов» вирионов

остается оболочка, которая может 'быть образована только М-белком (Schulze, 1972); 4) эксперименты с йодированием хлорамином Т показали, что М-белок, хотя и не расположен па поверхности вириона, является внешним по отношению к пуклеонротеиду (Stanley, Haslam, 1971); 5) исследования, .проведенные с помощью метода спектрофлуорометрии, показали возможность переноса энергии с М-белка на флюоресцентный зонд, внедренный в липидный бислой вириона (Lenard et al., 1974).

Приведенные аргументы указывают на тесную связь М-белка с внутренней частью мембраны; тем не менее этот белок, вероятно, не пронизывает насквозь двойной липидный слой и не выступает на внешнюю сторону мембраны. Это доказывается отсутствием действия на этот белок протеолити-ческих ферментов (Compans et al., 1970a; Schulze, 1970; Klenk et al., 1972a), недоступностью М-'белка для веществ, специфически реагирующих с поверхностными белками (Stanley, Ha'slam, 1971; Rifkin et al., 1972), и невозможностью обнаружить внутримембранные частицы при изучении мембран вируса гриппа с помощью метода сколов при замораживании (Bachi et al., 1969).

Из самого пространственного расположения М-белка, образующего каркас двойного липидного слоя, и того факта, что гликопротеиновые поверхностные «шипы» не играют основной роли в поддержании формы и целостности вирусной мембраны, можно сделать следующий вывод: вероятно, М-белок в вирусной оболочке играет основную структурирующую роль. Кроме того, этот белок обладает и другими функциями, которые вытекают из его расположения и свойств. Во время сборки оболочечных вирусов нуклеокапсид располагается под тем участком клеточной мембраны, который содержит вирусные поверхностные белки, что указывает на существование «узнавания» нуклеокапсидом этого участка мембраны.

Далее, во время сборки и отпочковывания вирусная оболоч-. ка формируется из клеточной мембраны, тем не менее в вирионе не содержится белков клетки-хозяина, что является дополнительным аргументом в пользу возможности миграции белков в плоскости клеточной мембраны. Эти факты наводят на мысль, что вирус имеет механизм для поддержания локализации своих компонентов вблизи той части клеточной мембраны, которая содержит вирусные белки и из которой удалены клеточные белки. Как уже предполагалось, наиболее вероятным кандидатом, осуществляющим как «узнавание» места локализации 'вирусного нуклеокаисида, так и поддержание вблизи мембраны вирусных компонентов, является М-белок (Choppin et al., 1972; Choppin, Compans, 1975; Compans, Choppin, 1975; Choppin, 1975).

НУКЛЕОКАПСИД

Внутренняя структура вирионов гриппа при негативном контрастировании препаратов проявляется достаточно редко, поэтому основная информация о структуре внутреннего ри-бо-нуклеоиротеида (РНП) была получена гари изучении изолированных РНП и вирусных частиц с помощью ультратонких срезов. Существует общее мнение, что РНП представлен в вир'Ионе в виде отдельных фрагментов, каждый из которых состоит из одной молекулы РНК, большого числа одинаковых молекул полипептада NP и, вероятно, из одной или нескольких молекул полимер-азы Р.

Ри'бонуклеоп'ротеид может быть выделен из вирионов в градиенте плотности после их разрушения с помощью обработки такими детергентами, как NP40 или эфир. Если структуры, полученные после такого выделения, исследовать с помощью негативного контрастирования уранилацетатом или фоефовольфрамовой кислотой (10 и 11), можно наблюдать нити диаметром 10—15 нм, длина которых варьирует в пределах 30—110 нм (Pons et al., 1969; Schulze et al., 1970; Corapans et al., 1972). Нити иногда имеют петли на одном из концов и хорошо различимые повторяющиеся следы глубокой и мелкой бороздок, свидетельствующих о том, что эта структура образована нитью, закрученной и свернутой в двойную спираль. На 12 [показана гипотетическая модель РНП. Препарат РНП можно фракционировать на несколько классов различающихся до размерам молекул с помощью скоростной седиментации, что отражает наличие в суммарной фракции фрагментов РНК с различной молекулярной массой (,Duesberg, 1969; Pon's, 1971). Фракции после разделения содержат структуры одинакового диаметра и существенно различной длины (Compans et al., 1972). Распределение по длине изолированных РНП было изучено в опытах с использованием в качестве контрастирующего вещества уранилацетата, который преимущественно связывается с нуклеиновой кислотой (см. 11). Наиболее быстро седимен-тирующий РНП имеет максимум на кривой распределения фрагментов по длине при 90—ПО нм, РНП со средними размерами — при 60—90 нм и самый короткий РНП — при 30— 50 нм. Эти значения длины РНП могут быть окоррелированы с молекулярной массой нуклеиновых кислот, входящих в состав РНП различных классов. Так, наибольший по размерам РНП содержит РНК с самой 'большой молекулярной массой— 106 (см. раздел II этой главы и гл. 6). В РНП приблизительно 10—12% массы приходится на РНК, а остальное — на белок, который практически полностью представлен еубъ-едивицами полипептида NP (Ponse et al., 1969; Krug, 1971). Используя эти данные, можно рассчитывать, что на 100 нм

нити РНП приходится около 150 субъединиц белка с молекулярной массой 60 000, т. е. один виток спирали РНП содержит приблизительно 12 субъединиц этого 'белка, и на одну белковую субъединицу приходится 20 нуклеотидов (Compans et al., 1972).

Исследование вирионов гриппа с помощью метода ультратонких срезов подтвердило ту точку зрения, что вирусный РНП представляет собой внутри 'вирусной частицы набор коротких фрагментов РНП (Compans, Dimmock, 1969; Bactu et al., 1969; Compan's et al., 1970b; Shulze, 1973). Вирионы в момент отпочковывания обычно слегка вытянуты и внутриви-русные нити РНП располагаются параллельно длинной оси частицы (Compans, Dimmock, 1969). Негативное контрастирование с помощью уранилацетата вирусных частиц, лишенных поверхностных «шипов» при обработке протеазой, выявило наличие большого количества внутривирусных нитей, морфология которых совпадала с морфологией РНП, изолированного из вирионов с помощью обработки детергентом (Schulze, 1973). Таким образам, различные методические приемы, позволяющие наблюдать внутреннюю структуру большего числа вирусных частиц популяции, обнаруживают, что РНП находится в вирусной частице во фрагментированном состоянии. При негативном контрастировании в некоторых вирионах наблюдаются большие бухтообразные структуры (Apostolov, Flewett, 1965; Almeida, Waterson, 1970; Schulze et al., 1970). Предполагалось, что эти структуры представляют собой «ин-тактные» нуклеокапсиды вирионов гриппа и что РНП, изолируемый из вирусных частиц, является продуктом фрагментации этих структур (Almeida, Waterson, 1970). Однако наличие петель на одном из концов изолированной нити нук-леО'Протеида, а также тот факт, что длины нитей сгруппированы в дискретные группы (Compans et al., 1972), .подтверждают точку зрения, согласно которой полученные при изоляции из (вирионов нити РНП не являются прямыми продуктами фрагментации больших по размерам структур. Кроме того, как уже было описано, при исследовании ультратонких срезов вирусных частиц, когда разрешается внутренняя структура большинства вирионов, 'большие бухтообразные структуры обнаруживаются очень редко, а иногда и вообще не наблюдаются. В.некоторых случаях подобные структуры находят в инфицированных клетках, однако еще нет доказательств, что они имеют какое-либо отношение ,к вирусным РНП. Наличие связи этих бухтообразных структур с вирио-нами будет доказано только после их изоляции в чистом виде и определения их химического состава.

На основании высокой частоты рекомбинаций, характерной для вирусов гриппа (см. гл. 7), предполагалось, чтс» фрагменты РНП включаются в вирусную частицу из внутриклеточного резервуара случайно (Hirst, 1962). Хотя может быть строго доказано, что в результате такого случайного процесса лишь в редких случаях будут формироваться ви-рионы, содержащие все фрагменты генома, необходимые для осуществления инфекционное, тем не (менее относительное количество инфекционных вирионов в 'популяции вируса значительно увеличится, если вирионы будут содержать избыточное количество фрагментов РНК (Compans et al., 1970b). Доказательство случайного включения фралментов РНК в вирионы гриппа основывается на наблюдении Hirst и Pons (1973), заключающемся в том, что агрегаты вирионов гриппа, как обнаруживаемые при нормальных условиях, так и образуемые искусственно с помощью нуклеогистона, обладают повышенной инфекционностью. Эти результаты указывают на наличие комплементации двух или большего числа вирусных частиц, каждая из которых в отдельности не содержит •полного набора 'фрагментов РНК, необходимого для осуществления инфекционности.

Рибонуклеопротеид вируса гриппа по некоторым своим свойствам отличается от спирального нуклеокапсида пара-миксовируеов. РНК нуклеопротеида вируса гриппа в отличие от РНК в составе нуклеокапсида парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1968) чувствительна к действию рибо-нуклеазы (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969; Pons. et al., 1969). Обработка РНП вируса гриппа поливинилсуль-фатом высвобождает РНК и образует .комплекс субъединиц .белка с поливинилсульфатом, структура которого очень сход-

на со структурой РНП (Pons et al., 1969; Goldstein, Pons, 1970). Нуклеокалсиды парамиксовирусов нечувствительны к такой обработке (Goldstein, Pons, 1970). Таким образом, механизмы взаимодействия РНК — белок для этих двух структур существенно различны, причем РНК вируса гриппа, входящая в состав РНП, вероятно, более доступна внешним •воздействиям.

Рибонуклеопротеид вируса гриппа чувствителен также к действию протеазы (Pons et al., 1969). При низких концентрациях проназы РНП не изменяет свои седиментационные параметры, однако при предварительной обработке препарата рибонуклеазой проказа приводит к деградации РНП (Duesberg, 1969). Следовательно проназа может расщеплять связи между субъединицами белка, не воздействуя на структуры, цельность которых определяется взаимодействием белковых субъединиц с молекулами РНК.

С РНП, изолированным из вирионов гриппа (Bishop, 1972) или из инфицированных им клеток (Caliguiri, Compans, 1974), вероятно, связаны минорные полипептиды Р. Поскольку в каждом фрагменте РНП может содержаться лишь несколько молекул этих полипштидов, кажется маловероятным, что они играют какую-либо роль в поддержании структуры РНП. Точная локализация молекул полипептидов Р пока неизвестна. Вероятно, они присоединяются к РНП менее прочно, чем молекулы полипептида NP, поскольку они могут удаляться во время очистки (Schulze, 1973). Минорные полипептиды Р могут входить в состав вирусной транскрип-тазы (Bishop et al., 1972) или 'быть инициаторными полипеп-тидами для «одевания» РНК белком РНП.