IV. Комплекс рнк с белком (рнп) а. Физические и химические свойства

При разрушении вирионов гриппа с помощью эфира (Hoyle, 1952; Lief, Henle, 1956; Davenport et al., 1959), дезоксихолата натрия (Duesberg, 1969; Kingsbury, Webster, 1969) или нонидета P40 (NP40) (Ponsetal., 1969) высвобождается стабильный комплекс РНК с белком. Этот нуклеопро-теид (РНП) содержит 10% РНК и 90% белка. Белковая компонента РНП имеет относительную молекулярную массу

около 55 000—65 000 и обозначается символом NP (Pons et al., 1969). Скоростное градиентное центрифугирование РНП в 10—35% глицериновом градиенте с 'использованием буфера STEU позволяет разделить РНП на три типа молекулярных комплексов со средними коэффициентами седиментации 48, 40 и 34S (Pons, 1971). Duesberg (1969), а также Kingsbury и Webster (1969) тоже изолировали три класса различных по размерам РНП, но с более высокими значениями коэффициентов седиментации—приблизительно 70, 60 и 50S. Разница в приведенных значениях коэффициентов седиментации, вероятно, связана с различием методов изоляции и анализа РНП, который имеет тенденцию IK агрегации в отсутствие мочевины или в растворах с низкой концентрацией солей. После фиксации РНП с помощью глютаральдегида его плавучая плотность в хлориде цезия равна 1,34 г/см3 (Krug, 1971).

Pons (1971), используя анализ изолированного РНП с помощью ПААГЭ, доказал предположение Duesberg (3969), Kingsbury и Webster (1969) о том, что каждый из различных по относительной 'молекулярной массе фрагментов РНП, изолированных с помощью центрифугирования в градиенте плотности, представляет собой комплекс разных по размерам молекул РНК с белком NP. В настоящее врехмя нет доказательств существования единой цепочки РНП (структура, в которой фрагменты РНК удерживаются на непрерывной цепи субъединиц NP) как в вирмоне, так и в инфицированной клетке.

В отличие от РНП парамиксовирусов (Compans, Choppin, 1967) РНП вируса гриппа чувствителен к действию РНК-азы (Duesberg, 1969; Pons et al., 1969). Обработка РНП проказой приводит к расщеплению -белка NP и к высвобождению вирусной РНК (Pons et al., 1969). Мяша(я обработка проназой не вызывает деградации белка NP (Duesberg, 1969). Приведенные экспериментальные данные указывают на стериче-окую доступность как 'белка, так и РНК, входящих в РНП-комплекс, хотя каждая из составных частей РНП и экранирует связанную с ней макромолекулу.

Pons и соавт. (1969) провели электронно-микроскопическое изучение изолированного РНП, оттеняя его с помощью укранилацетата или негативно контрастируя его фосфоволь-фраматом калия. Наблюдаемые структуры имели спиральные или окрученные торцовые сечения с противоположио направленными глубокой и мелкой бороздками и с петлями на каждом из концов. Эти структуры -были различной длины: в пределах от 50 до 150 нм и постоянной толщины: 15 ям (7,5 нм для концевых петель) (Schuize et al., 1970) (29, A). Corn-pans и соавт. (1972) получили аналогичные результаты и показали, что длина каждого из фрагментов РНП отражает

длину молекулы РНК, входящей в его состав. Морфологически РНП представляет собой комплекс, состоящий из РНК и белка, закрученный сам на себя с образованием высоко-спиральной структуры, причем ни РНК, ни белок не являются чехлом для другой макромолекулы, входящей в состав рибонуклеопротеида.

Scholtissek и Becht (1971) показали, что белок NP имеет одинаковое сродство к вРНК и >к вкРНК- Он также присоединялся к клеточным РНК, содержащим в большом количестве АМФ, и к другим одноцепо'чечным РНК. С двунитчаты-ми РНК белок не взаимодействовал. Как 'было указано, РН'П-комплеке стабилен в 1 М мочевине, а также в 0,8 М Nad или в 1 М КС1. В условиях in vitro, по-видимому, нет высокой специфичности во взаимодействии между молекулами белка NP и РНК- Другого рода указание о потере специфичности 'было проведено в исследованиях Pons и соавт.(1969), Goldstein и Pons (1970). Как показали эти авторы поливинилсульфат (PVS) вытесняет РНК с белкового остова, что -приводит к возникновению комплекса PVS-NP, который имел седиментационные свойства и морфологию, сходную с исходным РНП (29,.6). Свободная вирусная РНК, се-диментирующая при 18S, была чувствительна к расщеплению РНК-азой, как это наблюдается для РНК, выделенной с помощью фенольного метода, в то время как комплекс PVS-NP был нечувствителен к действию РНК-азы. Результаты описанных экспериментов указывают на то, что морфология РНП в основном определяется взаимодействием между молекулами NP. Действительно, комплекс имеет сходную структуру вне зависимости от того, связывается ли молекулуа NP с РНК или с резко отличной от нее (Молекулой PVS. Кроме того, .комплекс PVS-NP, идентичный физически и морфологически РНП, может быть получен только в случае, когда PVS добавляется к ннтактному РНП. Добавление PVS к свободным субъединицам NP приводит к возникновению гетерогенной смеси молекул (комплекса PVS-белок, который не сходен с РНП ни в еедиментационном, ни в морфологическом отношении. Взаимодействие PVS с РНП также указывает на то, что, как .было отмечено Schulze (1973), в формировании РНП играют роль в основном зарядовые взаимодействия между молекулами белка и фоофоэфиряого остова РНК, поскольку РНК может быть заменена полимером, содержащим в своем составе заряженные фосфатные группы.

Для изоляции РНП из инфицированных клеток 'было разработано несколько различных методов (Pons, 1971, 1972). При использовании любого из них выделялся РНП, плавучая плотность, коэффициент седиментации и морфологические характеристики которого были идентичны характеристикам ви-рионного РНП. Имелось только одно различие между РНП, выделенными из вирионов и из инфицированных клеток: ви-рионный РНП состоял из белка, находящегося в комплексе только с вРНК, в то время как 90% клеточного РНП содержало вРНК, а 10% — BIKPIHK. В отличие от Krug (1972), который обнаружил свободную BIKPHK В инфицированных .клетках, мы не обнаружили свободной вирусспецифической РНК в клетке (кроме днРНК). Наш метод выделения давал нам всю внутриклеточную вирусспецифичеокую РНК в виде РНП. Причины приведенного различия в результатах пока неясны.

Б. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНП

До сих пор нет доказательства того, что белковая часть РНП играет какую-либо другую роль, кроме осуществления функции защитного чехла для РНК. Возможно, что сегменты

РНК могут быть связаны в единую цепь на непрерывном остове NP-белка. Хотя такого рода структура и не обнаруживалась, тем не менее была предложена модель репликации РНК, предполагающая ее существование (Pons, 1970). Кроме того, белок NP или сам РНП может обладать некоторой регуляторной функцией при транскрипции, трансляции или репликации. Ответы на эти вопросы могут быть найдены в процессе изучения транскрипции и трансляции в системе in vitro.

Hir'st и Pons (1972) обнаружили, что вирусные экстракты, содержащие РНП штамма вируса гриппа дикого типа (WSN), имели более высокую восстанавливающую активность (marker rescue) в опытах с температурочувствительны-ми мутантами. Природа и строение вещества, вызывающего эффект .восстановления, неясна, однако свободная вирусная* РНК, выделенная из вирионного РНП с помощью смеси фенол—SDS или при обработке его лолививидеульфатом, была: полностью неактивна в этом отношении. Существенно ли для: восстановительных свойств препарата присутствие в системе: только белка NP или смеси этого белка с полимеразой — еще не ясно.

V. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИЕ РНК

А. ВИРИОННАЯ РНК

1. Синтез вРНК

Несмотря на то что до настоящего времени было выполнено большое число работ, посвященных изучению синтеза РНК 'вируса гриппа в клетке-хозяине, интерпретация их результатов была осложнена в результате того, что вирусная репликация ингибировалась в присутствии актиномицина D (AD). Некоторые авторы (интерпретируют свои результаты, считая, что синтез вирусной РНК становится нечувствительным к AD спустя 2—27г ч после начала инфекции (Barry et al., 1962; Barry, 1964; Granoff, Kingsbury, 1964; Kingsbury, 1970; Blair, Duesberg, 1970). Тем не менее имеется другая точка зрения, согласно которой AD обладает ингибирующим действием вне зависимости от времени его введения в систему (Scholtissek, Rott, 1970; Gregoriades, 1970; Pons, 1973). Эти работы будут подробно обсуждены в разделе VIA. Мы: подняли здесь этот вопрос только для того, чтобы подчеркнуть тот факт, что исследования, о которых будет сказано далее, в основном были выполнены без применения каких-либо ингибиторов синтеза вирусной РНК и в связи с этим потребовали значительных усилий для разделения вирусспепифических продуктов и продуктов клетки-хозяина в процессе созревания вируса.

Как указывалось в разделе ПВ, 1 вирусспецифические РНК имеют среднее значение 'коэффициента седиментации, равное 18S. Рибоеомалыные РНК клеток-хозяев млекопитающих седиментируют при 28 и 18S. Таким образом, при использовании ингибиторов синтеза рибосомальной РНК клетки-хозяина трудно сделать какие-либо заключения о синтезе вирусной РНК. в связи с тем, что 18S РНК входит в состав как вируса, так и клепки-хозяина. Для преодоления этой трудности был разработан метод выделения из клетки вирусных РНК в виде РНП. Р'ибонуклеопротеид имеет средний коэффициент седиментации 30—50S, стабилен в присутствии ЭДТА, высоких концентраций солей и мочевины (эти виды обработки разрушают рибосомы клетки-хозяина) и может быть сконцентрирован осаждением в изоэлектрической точке (Schafer, Munk, 1952). Используя эти свойства РНП, для его изоляции инфицированные клетки разрушают с помощью NP-40, РНП извлекают и концентрируют с помощью преципитации в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и очищают скоростным центрифугированием 1—2 раза через глицериновый градиент (Pons, 1971). Изолированный и очищенный таким способом РНП имеет плавучую плотность, седиментационные характеристики и морфологию вирионного РНП. Однако в то время как вРНК не обладает способностью ж самогибридизации, до 20% РНК, выделенной из внутриклеточного РНП, самогибридизуется. Эти данные совместно с данными конкурентной самогибридизации указывают на то, что внутриклеточный РНП содержит 90% вРНК и 10% вкРНК (Pons, 1971).

Scholtissek и соавт. (1969) сообщили, что синтез вирусной РНК связан с синтезом полипептида NP. Этот факт позволяет изучать кинетику синтеза вирусной РНК по возникновению в клетке РНП. Кроме того, использование методов, разработанных для изучения внутриклеточного синтеза в процессе клеточной репликации, 'позволило высказать точку зрения, что в клетке нет свободных вируослецифических РНК (Pons, 1971, 1972). Это означает, что, как только происходит синтез цепи РНК (или даже во время самого синтеза), она ассоциируется с молекулами 'белка NP. Krug (1971), однако, интерпретировал полученные им данные на основе .предположения о том, что синтез вкРНК происходит намного раньше, чем образование вкРНП. Несмотря на это несоответствие точек зрения, по-видимому, все же правомочно рассматривать синтез РНП в качестве критерия синтеза РНК. Pons (1971) показал, что РНП можно обнаружить уже через 1 ч после начала инфекции. Ранее было обнаружено, что вирус-специфическая днРНК может быть, найдена в клетке спустя

'/г ч после начала инфекции (Pons, 1967b). Это различие можно объяснить просто методологическими трудностями экстраполяции кривой синтеза РНП в начальной точке отсчета времени. Кинетика синтеза РНП имеет все черты, характерные для синтеза самореплицирующихся молекул (Pons, 1971).

В заключение следует отметить, что полученные данные указывают на то, что синтез вирусной РНК, наблюдаемый по возникновению РНП, начинается почти сразу же после начала инфекции. Асимптотическое поведение кривой кинетики накопления РНП указывает на наличие самодуллицирующихся молекул. В случае использования монослоев клеток куриных фибробластов синтез РНП начинается максимум через 4—5 ч после инфекции, когда во внеклеточной жидкости обнаруживаются вновь синтезированные вирусные частицы, и некоторые кленки деградируют. Другой аспект проблемы внутриклеточного синтеза вирусной РНК состоит в том, где синтезируется эта РНК- Этот вопрос будет рассмотрен в гл. 8.