III. Структура гемагглютинина

Общие аспекты структуры вируса гриппа, включая полипептидный состав вириона, (были уже рассмотрены в гл. 2. Здесь мы остановимся только на специальных вопросах структурной организации гемагглютинина. В частности, будут рассмотрены методы очистки этого гликопротеида, химический состав субъединиц, формирующих гемагглютинин, а также трехмерная структура активной формы этой молекулы.

А. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Для разрушения вирионов гриппа используют большое число детергентов: нонидет — Р40, тритон XI00, дезоксихолат натрия, саркозил NL30 и додецилсульфат натрия (SDS). Пороговая концентрация мицеллообразования первых четырех детергентов достаточно низка и поэтому используемые для разрушения вируса водные растворы их не денатурируют большую часть белков. С другой стороны, SDS используют в достаточно высоких концентрациях, при которых возникают денатурационные изменения в большинстве белков. Однако, несмотря на это, тем агглютинин некоторых штаммов вируса сохраняет свою активность при контакте с SDS (Laver, 1963). Одна из первых методик для отделения гемагглютинина от нейраминидазы без использования протеаз была основана именно на этой высокой стабильности гемагглютинина (Laver, 1964). Додецилсульфат натрия денатурировал вирусные белки, отличные от гемагглютинина, которые мигрировали при рН 9,0 как анионы, в то время как гемагглютинин мигрировал как катион. Таким образом, гемагглютинин мог быть очищен с помощью электрофореза на ацетате целлюлозы. С помощью этой методики был очищен гемагглютинин вируса гриппа штамма Bel, и для него была получена обширная информация, описанная в этом разделе.

К сожалению, указанная методика не может быть использована для всех штаммов вируса гриппа. Гемагглютинин большинства штаммов денатурирует в присутствии SDS. При использовании же других детергентов не денатурирует ни гемагглютинин, ни нейраминидаза, но они не разделяются при электрофорезе. Гемагглютинин из этих штаммов может быть изолирован в чистом (виде только после получения рекомбинантов с SDS-чувствительной нейраминидазой. В связи с этим выделение гемагглютинина из большинства штаммов вируса является довольно сложной задачей.

Гемагглютинин штамма Х-31, рекомбинанта H0N1-H3N2, получившего гемагглютинин и нейраминидазу от H3N2-po-дителя (Kilbourne, 1969), был извлечен из вируса с помощью бромелайна и очищен с помощью ультрацентрифугирования (Brand, Skehel, 1972). Гликопротеид, очищенный таким образом, образовывал кристаллы при вакуумном диализе против дистиллированной воды. Этот метод был успешно апробирован для некоторых штаммов вируса гриппа А и В. Однако чистые белки, полученные этим способом, вероятно, отличаются от белков, присутствующих в вирионе, как по своей структуре, так и по функции.

Недавно были разработаны две методики, в которых для разрушения вируса использованы неденатурирующие детергенты с последующей хроматографией продуктов фрагментации вирионов на DEAE-целлюлозе в присутствии низких концентраций детергентов для поддержания компонентов в неагрегированном виде (Gregoriades, 1972; Stanley et al., 1973b). Эти методики еще не нашли широкого распространения, однако по теоретическим соображениям они должны иметь преимущества перед методам с использованием SDS для разрушения вирусных частиц с последующим электрофорезом. В связи с тем что при использовании описываемого метода разделения из одного и того же вирусного препарата изолируются как гемагглютинин, так и нейраминидаза, можно ожидать, что метод с использованием DEAE-целлюлозы найдет широкое применение для выделения из большого числа штаммов препаративных количеств вирусных антигенов.

Б. ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ СУБЪЕДИНИЦЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

Гемагглютинин составляет 25—35% всех белков вириона. Эти данные были получены при анализе электрофоретических профилей в полиакриламидном геле, полученных для полипептидов четырех штаммов вируса гриппа типа А, культивированных на различных клетках-хозяевах (Schulze, 1973). Около 6% сухой массы вируса составляют углеводы (Ada, Perry, 1954; Frommhagen et al., 1959), большая часть которых ассоциирована с гемагглютинином. Таким образом, гемагглютинин представляет собой гликопротеид, 15—20% сухой массы которого представлены углеводами. Гемагглютинин формируется из субъединиц гликопротеида с молекулярной массой около 80 000, который был обозначен символом НА (Kilbourne et al., 1972а; см. также гл. 2). Поскольку химический состав олигосахаридов, ассоциированных с вирионом, определяется клеткой-хозяином, вирионы, культивированные на различных клетках-хозяевах, содержат молекулы гемагглютинина, различающиеся по своим размерам (Compans et al., 1970b; Haslam et al., 1970; Schulze, 1970).

При определенных условиях выращивания вируса из субъединицы НА путем ее протеолитического расщепления формируются два гликопротеида HAi и НА2. Факторы, определяющие наличие такого расщепления, обсуждаются в гл. 2 и 8. Расщепление не является необходимым условием образования функционального «шипа» и не приводит к потере гемагглютинирующей активности и инфекционности (Laza-rowitz et al., 1971, 1973a; Stanley et al., 1973a). В субъединице НА, подвергшегося расщеплению, два гликопептида удерживаются в непосредственной близости друг от друга за счет существования дисульфидных мостиков и могут диссоциировать при совместном действии SDS и восстанавливающих агентов (Laver, 1971).

Определение молекулярной массы для HAi и НА2, изолированных из нескольких препаратов вируса, культивированного на одних и тех же клетках-хозяевах, показали, что эти гликопептиды варьируют по размерам от препарата к препарату не более чем интактные субъединицы НА (Schulze, 1970). Однако полосы НА; и НА2 при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле обычно шире, чем полоса НА, что указывает на наличие гетерогенности обоих продуктов расщепления. Величины молекулярной массы HAi и НА2, полученные от двух штаммов вируса, культивированных на одних и тех же клетках, также могут различаться (Klenk et al., 1972; Stanley et al., 1973a). Таким образом, различие в последовательности аминокислот полипептида НА приводит к различиям либо в месте расщепления, либо в распределении олигосахаридных цепочек вдоль молекул полипептидов. Расщепление, вероятно, возникает в одинаковых, ограниченных по числу, местах полипептидной цепи в случае культивирования вируса в определенных условиях. Гликопептиды HAi и НА2 могут быть получены с помощью обработки вирионов трипсином (Schulze, 1970; Lazarowitz et al., 1971, 1973a) или плазмином (Lazarowitz et al., 1973b; см. также гл. 2). В этих условиях расщепление должно приводить к образованию продуктов НА, и НА2; на С-конце одного из которых находится остаток аргинина или лизина.